川芎嗪对大鼠移植肝的保护作用
作者:刘胜雄，欧阳永忠，汤明，吴飞跃
【摘要】 目的 探讨川芎嗪（TMP）对大鼠移植肝的保护作用。方法 参照Delriviere和Kamada等方法建立大鼠肝移植模型，将大鼠随机分为3组：A组（假手术组）、B组（肝移植对照组）和C组（TMP干预组）。采用全自动生化分析仪检测术后血清肝功能(AST、ALT、LDH)水平；应用免疫组化SP法结合病理图像分析仪测定肝组织中Bcl-2、Bax的表达情况；HE染色观察其病理形态学变化。结果 （1）C组AST、ALT、LDH明显低于B组（P<0.01）。（2）C组Bcl-2或Bcl-2/Bax表达明显高于B组（P<0.05），而Bax表达无明显变化（P>0.05）。（3）A组无明显病理形态改变，B组术后肝组织出现明显的病理损害，C组病理变化明显减轻。结论 TMP可能通过上调Bcl-2或Bcl-2/Bax表达而减轻肝移植体的低温保存再灌注损伤，对供肝有保护作用。
【关键词】 肝移植；保存再灌注损伤；川芎嗪；Bcl-2；Bax
Protective effect of tetramethylpyrazine on liver graft in rat liver transplantation
【Abstract】 Objective To investigate the protective effect of tetramethylpyrazine (TMP) preconditioning on liver graft in rat liver transplantation.Methods Performing the operation of liver transplantation in male Sprague-Dawley rats referred to Delriviere and Kamada with cuff anastomosing methods，the rats were randomly divided into three groups：A group(n=6，sham operation group)，B group (n=30×2，liver transplantation control group)，C group (n=30×2，TMP group).The parameters of liver function (AST，ALT and LDH) were tested by auto-biochemical analyser in group B and C after reperfusion 0.5h，3h，6h，24h，48h respectively via the plasma samples；part of the liver tissue was sampled to determine the expression of Bcl-2 and Bax.The parameters in group A were examed 3h after the operation.The expression of Bcl-2 and Bax was determined by immunohistochemisty technique with pathological imaging analyser.Also，parts of liver tissue samples were used to detect the histopathologic changes.Results （1）The levels of AST，ALT and LDH were significantly decreased in group C compared with that in group B （P＜0.01）after reperfusion 0.5h，3h，6h，24h，48h respectively.（2）The expression of Bcl-2 were significantly increased in group C compared with that in group B （P＜0.01）after reperfusion 0.5h，3h，6h respectively.The different expression of Bax between group C and group B was nonsignificant.（3）Approximately normally morphologic structure was found in group A，some obvious histopathologic changes in group B could be seen morphologically.But in group C，some histopathologic changes were alleviated.Conclusion TMP can improve liver function and alleviate histopathologic damage in liver transplantation in rats during preservation and reperfusion injury probably by up-regulating the expression of Bcl-2 or Bcl-2/Bax and exert a protective effect on liver graft.
【Key words】 liver transplantation；preservation and reperfusion injury；tetramethylpyrazine；Bcl-2；Bax
肝移植是治疗终末期肝病最有效的手段，肝移植体低温保存再灌注损伤是肝移植术后肝原发性无功能（PFN）的重要原因，与细胞凋亡密切相关。目前人们针对凋亡发生的各个环节，探索各种防治方法，从而减轻肝移植体保存再灌注损伤成为了研究的热点。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP，四甲基吡嗪）是从中药川芎中分离、纯化的一种生物碱，TMP具有抑制血小板的聚集、改善微循环、保护血管内皮细胞、对抗氧自由基的氧化作用以及钙拮抗作用；TMP作为钙拮抗剂，可能通过激活腺苷酸环化酶及抑制钙离子内流作用而抑制细胞凋亡［1］；TMP还可以影响c-fos表达而抑制细胞凋亡［2］。但目前TMP在细胞内的分子机制研究甚少，需进一步研究。TMP是否影响移植肝保存再灌注损伤细胞凋亡调控基因的表达，尚未见报道。本实验通过建立大鼠肝移植模型，观察TMP对保存再灌注损伤中肝组织Bcl-2、Bax表达的影响，探讨TMP对大鼠移植肝的保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料 封闭群雄性SD大鼠126只，供体体重200～250g，受体体重340～380g，实验动物购于中南大学实验动物中心。SSW-3X显微外科手术器械包（上海医疗器械有限公司）。Q550CW自动病理图像分析仪（德国LEICA公司）。TMP（40mg/2ml/支，北京第四制药厂）。Bcl-2、Bax免疫组化试剂盒、AST、ALT、LDH试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。
1.2 实验分组及处理 封闭群SD大鼠（n=126）随机分为3个组：A组（n=6，假手术组）、B组（n=30×2，肝移植对照组）、C组（n=30×2，TMP干预组）；B、C组再根据再灌注后0.5h、3h、6h、24h、48h不同时相，又分为5个亚组。
1.3 制备大鼠肝移植模型 参照Delriviere和Kamada等［3］方法建立大鼠肝移植模型。安体醚吸入麻醉，供体肝上上腔静脉结扎，供体肝下上腔静脉与受体右肾静脉按照Delriviere等［4］方法行袖套吻合（套管内径为2.0~2.2mm、外径为2.8~3.0mm）；供肝门静脉与受体门静脉行袖套吻合（套管内径为1.5~1.8mm、外径为2.0~2.2mm）；结扎受体肝固有动脉；最后将供肝胆管与受体胆管采用套管法重建（内径为0.65mm、外径0.96mm硬膜外导管）。B组：灌洗及保存液为4℃冷平衡盐溶液（含肝素钠5u/ml）；C组：灌洗及保存液为冷平衡盐溶液中加TMP（320g/L）；A组：开腹后游离肝周韧带，分离胆总管及门静脉，关腹。
1.4 标本的采集和检测 B、C组观察术后的一般情况，并分别于肝移植再灌注后0.5h、3h、6h、24h、48h取腹主动脉血待测肝功能（AST、ALT、LDH），同时取移植肝一小块肝组织待制石蜡标本；A组于关腹后3h取标本作为正常对照。采用全自动生化分析仪进行肝功能测定；利用免疫组织化学染色的方法结合病理图像分析测定各切片中细胞凋亡调控基因Bcl-2、Bax表达情况。取部分切片进行常规HE染色，光镜下观察肝组织的病理形态学变化。
1.5 免疫组化染色方法 石蜡切片常规脱蜡至水；3%过氧化氢阻断内源性过氧化酶活性；微波修复抗原，加封闭用羊血清，37℃孵育15min；加1∶50 Bcl-2或1∶50 Bax抗体工作液，4℃孵育过夜；滴加生物素的羊抗兔IgM（1∶100），37℃孵育30min；每张切片滴加50μl SP复合物，于37℃孵育30min；以新鲜配制的DAB显色，苏木素复染，封片，显微镜下观察。镜下可见阳性染色主要位于胞浆内，少数为核膜，呈浅黄、棕黄或棕褐色颗粒。每张切片内中外随机选取6个视野，运用病理图像分析仪显微镜下观察并测定阳性细胞的辉度值（与Bcl-2、Bax表达成反比）。
1.6 统计学方法 所有计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，在计算机上用SPSS 11.0软件包处理，方差齐性分析后，组间比较用均数t检验，组内比较用单因素方差分析，组内不同时点间两两比较采用q检验，指标间相关分析用直线相关分析，P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 一般情况 本实验肝移植60例，供体手术时间、血管袖套准备时间、受体手术时间、无肝期分别为（29.65±3.18）min、（9.05±2.12）min、（42.64±4.07）min、（5.18±1.23）min。手术成功率为88.33%（53/60）。本实验发现，肝移植TMP干预组较肝移植对照组在供肝恢复血流后，其表面很快呈鲜红色，无花斑状表现，门静脉不扩张，肝脏无肿胀，肠管无淤血，肠系膜动脉搏动有力，胆汁源源不断流出，上述表现明显优于肝移植对照组。
2.2 肝组织形态学变化 假手术组（A组）无明显形态学改变；肝移植对照组（B组）术后肝组织随着再灌注时间的延长，病理变化逐渐加重：肝细胞排列紊乱，细胞浊肿，变性呈颗粒状，肝窦变窄，中性粒细胞附壁，继而出现细胞核染色加深及部分核浓缩，部分还出现点状或小片状坏死，以术后6h最严重，6h后，病理变化随着再灌注时间的延长逐渐减轻；肝移植TMP干预组（C组）病理变化较B组相应时点明显减轻：轻度的组织水肿，肝窦内皮渗出较少，小叶结构基本完好，炎症细胞浸润较少（见图1～2）。
图1 B组再灌注后6h肝组织HE染色（×100）
图2 C组再灌注后6h肝组织HE染色（×100）?
2.3 大鼠各组AST、ALT、LDH含量 与A组比较，B、C组各时点AST、ALT、LDH含量均显著性增加（P＜0.01）；与B组相应的时点比较，C组各时点AST、ALT、LDH含量显著性降低（P＜0.01）；B、C组内各时点间AST、ALT、LDH含量单因素方差分析差异显著（P＜0.01），且每两个时点间q检验有显著性时效关系（P＜0.05），见表1。
