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组织型纤溶酶原激活因子对生物材料表面血小板黏附的体内和体外实验研究

作者:舒胜强
出处:论文网
时间:2006-11-17
 【摘要】  目的  本文观察组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)包被Dacron和PTEE材料对表面血小板黏附的体内和体外实验。方法  通过体内和体外动物模型实验,观察血小板在材料表面的黏附情况和对机体内血小板黏附的影响。结果  通过t-PA处理后,上述两种材料表面的血小板黏附数目较对照组明显减少(P<0.01),机体内血小板黏附也较空白组明显减少 (P<0.01)。结论  t-PA可通过抑制血小板在材料表面的黏附,进而推断可以用于防治生物材料的细菌黏附。组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)具有特异的溶栓作用。
   
    【关键词】  组织型纤溶酶原激活因子(t-PA);包被Dacron;PTEE;表面血小板
   
    近年来的很多研究表明[Lin TL,Lu FM,Sheu MS. Antimicrobial coatings: A remedy for medical device-related infections. Med Dev Tech,2001],在由生物材料引发的感染(biomaterial centered infection,BCI)中,45%的原因是因为生物材料与人体接触时,血液和组织中的纤维粘连蛋白(fibronectin)、玻璃粘连蛋白(vitronectin)和纤维蛋白原(fibrinogen)会吸附在材料表面,形成一层蛋白膜,而细菌很容易在这层蛋白膜上黏附,继而生长繁殖,逐渐形成一层顽固的水合多聚糖性质的生物活性膜(biofilm)[1]。这层生物膜可以吸收营养物质,具有一定厚度,产生很强的抗药能力,传统的抗菌治疗是无法根除的。根据细菌性感染的机理,本文就t-PA对生物材料表面血小板黏附的作用及影响进行初步探讨。
   
    1  实验材料与方法
   
    1.1  材料和仪器  涤纶(Dacron)B型(苏州华明织带有限公司),膨体聚四氟乙烯(PTEE,美国Gore&Associates公司)。谷胱苷肽硫基转移酶(Glutathione-S-trasferase,GST)和GST-t-PA融合蛋白由实验室制备,液体培养基(法国生物梅里埃公司)。
   
    1.2  材料的包被  将Dacron和PTEE薄膜剪裁成96孔酶标板等大的原片,用蒸馏水充分漂洗干净后在70%的酒精中浸泡30min,无菌条件下取出、晾干,置入96孔板中,每种材料分成3组,每孔分别加入100μl含0.5mg/ml GST-t-PA的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)或含0.5mg/ml GST的Tris-HCl缓冲液或单纯的Tris-HCl缓冲液,4℃放置过夜,弃去上清液,用Tris-HCl缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0/120mM NaCl)轻轻漂洗两次移入新的96孔板孔中备用。
   
    1.3  材料植入动物模型的制作  2.5~3.0kg雄性新西兰大耳白兔72只(武汉大学医学院动物实验中心),随机分为3组(各组24只):空白对照组,GST蛋白组和GST-t-PA蛋白组,每组又分为两组,D组(放置Dacron片)和PEET组(放置PEET片)。
   
    动物称重后,2%戊巴比妥钠(35mg/kg)耳缘静脉麻醉动物,备皮消毒后沿股动脉走向切开皮肤,分离出两侧的股动脉和股静脉,结扎股动脉的侧枝循环,经股静脉注射肝素(10U/kg体重),5min后从两端夹闭股动脉,其间间隔不小于6cm,用眼科剪剪开0.3cm左右的纵口,用生理盐水将血管内的血液冲洗干净,然后放入经GST蛋白或GST-t-PA蛋白包被处理的两种涤纶材料膜片,空白组进行手术后血管缝合,不予以任何处理。用3-0聚丙烯线缝合血管,移去动脉夹使血流再通,密切观察手术处股动脉搏动情况。麻醉恢复后,正常饲养。于术后第2天,每组随机选8只行血小板沉积实验。
   
    1.4  血小板在材料表面黏附的观察(体外实验)  取空白组新鲜兔动脉血,按9∶1的比例与3.8%的枸橼酸钠溶液混匀,离心分离富含血小板的血浆,用PBS将血小板数目调节至106/ml,取150μl加到上述处理的材料表面然后于37℃放置30min,弃取血浆,用PBS将材料膜片轻轻漂洗3遍后用2.5%的戊二醛固定2h,经冷冻干燥后进行扫描电镜观察。随机选取6个视野进行血小板计数。
   
    1.5  对机体内血小板黏附的观察(在体实验)  在植入物后2天,各组8只动物按前述方法麻醉,常规分离提取血小板,于血小板悬液内逐渐滴加Cr51铬酸钠溶液18.5MBq(0.5mCi)。将51Cr标记的血小板悬液2ml经股静脉注入体内,1h后取出移植材料,用PBS轻轻冲洗,并置于γ记数井中记数,同时抽取全血标本确定以确定游离和细胞51Cr活性,测定血小板计数和凝血酶原时间(PT)。
   
    2  结果
   
    2.1  血小板在材料表面黏附的观察(体外实验)  结果显示,用t-PA重组蛋白及GST蛋白处理医用Dacron及PEEP片,可明显抑制血小板在其表面的粘附,对Dacron片,用GST包被使其表面的血小板数目比对照组减少了大约42.3%(P<0.01);而TFPI重组蛋白处理组的血小板粘附数目减少更为明显,与对照组相比减少了大约76.4%(P<0.01)。在聚氯乙烯材料的实验中,也得到了类似的结果,其中GST处理的材料表面的血小板数目比对照组减少了大约34.1%(P<0.05);TFPI重组蛋白比对照组则减少了大约74.8% (P<0.01)。在两种材料的实验中GST组与TFPI重组蛋白组之间相比都有明显的差异(P<0.05) (见图1)。 

图1

    2.2  在体实验中机体内血小板沉积的影响  在体实验研究表明,Dacron组中,GST-tPA组血管血小板沉积明显少于GST组和空白对照组载体组和空白对照组,(P<0.05);PEEP组也得出相同的结论。见表1。

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关键字:组织型纤溶酶原激活因子(t-PA) 包被Dacron PTEE 表面血小板
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