氟西汀对海马神经元生长的影响
【关键词】 氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠
氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之 一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。
1 材料与方法
1.1 新生大鼠海马神经元的分离和培养
技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24 h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank's液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离 心管中，加入等量0.25%的胰酶（美国Sigma公司），37 ℃消化30 min，中间振摇1或2次，加入10%的 DMEM/F12（美国Gibco公司）5 ml，轻轻吹打15次，然后1 000 r · min-1离心5 min，制成单细胞悬液，置于CO2 培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目 的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200 μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4 h后换为 无血清培养基，即含2% B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养 6 d的神经元进行染色鉴定。
1.2 大鼠海马神经元的鉴定
1.2.1 烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色
取培养6 d 6孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的NSE免 疫组织化学染色。弃去培养液，4%多聚甲醛室温固定1 h ，加入 0.3% H2O2甲醇去除内源性过氧化氢酶，0.1% TritonX-100破膜，10%绵羊血清封闭，加入一抗1∶200 兔抗鼠 NSE抗体，4 ℃湿盒过夜，0.01 mmol ·L-1PBS清洗，加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG，放入 37 ℃温箱孵育 60 min;0.01 mmol · L-1 PBS 清洗，滴加SABC过氧化物酶复合物，37 ℃温箱中孵育 60 min，0.01 mmol · L-1PBS清洗，滴加 DAB显色液作用3～10 min，自来水冲洗后，常规脱水，透明封片。光镜下观察NSE表达阳性细胞。
1.2.2 尼氏染色
6孔培养板的细胞培养7d时，取出盖玻片进行尼氏染色。弃去培养液，0.01 mmol · L-1PBS清洗，4%多聚甲醛室温固定1 h，0.01 mmol · L-1PBS清洗 3次，氯仿中1 min，95%、70%乙醇各1 min， 蒸馏水清洗，置于1%甲苯胺蓝染液中染色20 min，95%乙醇分化，在显微镜下观察控制，时间以尼氏体显示清晰为准，37 ℃干燥，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。
1.3 实验分组
在培养的第3天加入氟西汀（常州第四制药厂生产），根据药物浓度不同，将实验细胞分为5组，分别加 入1、10、20、40 μmol · L-1氟西汀;正常对照组加入等体 积的培养基。
1.4 海马细胞形态定量分析
倒置相差显微镜（德国Zeiss公司产品）下观察加 药48 h后的海马神经元形态，每组各孔随机选择20个视野（每个视野0.17 mm2），记录每个视野内细胞长出突起的神经元数目，目镜测微尺随机测量15个神经元突起的长度和胞体的长径。
1.5 统计学处理
应用SPSS12.0软件进行统计分析，各项检测结果以x-±s 表示。多组比较及组间两两比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 海马神经元形态学观察
倒置相差显微镜下观察，培养1 d，细胞绝大部分贴壁，细胞形态大小不一，以单突起的小细胞为主。培 养6 d，神经元胞体较大，突起进一步增多、延长，并形成稀疏的网络（图1）。培养12 d，神经元胞体进一步增 大，突起形成比较稠密的网络。培养24 d，神经元胞体出现空泡，部分神经元死亡，胞体崩解，突触断裂。
2.2 海马神经元鉴定
NSE免疫细胞化学染色:染色后光镜下观察第6 天的神经细胞，胞浆和突起被染成棕黄色为NSE抗体 表达阳性细胞，以3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，经鉴定神经元的纯度为 90%。见图2A。
2.3 氟西汀对海马神经元形态学的影响
结果见表1和图3。不同浓度的氟西汀对海马神 经元形态学指标的影响是不同的，10 μmol · L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数 目增加、最长突起长度增长（ P <0.05）; 40 μmol · L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经 元数目减少（ P <0.05），最长突起长度及胞体长径无 显著性差异（ P >0.05）;1、20 μmol · L -1 氟西汀组海马 神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、最长突 起长度及胞体长径无显著性差异（ P >0.05）。 表1 氟西汀对加药48 h海马神经元形态学的影响（略）
