二氮嗪对深低温脑缺血再灌注大鼠脑组织NR1表达的影响
作者：陈凤，莫绪明，顾群，彭卫，何晓敏，戚继荣
【摘要】 目的 探讨二氮嗪对深低温缺血再灌注大鼠的脑保护作用及其机制。 方法 采用双侧颈总动脉阻断法制作 深低温缺血再灌注大鼠模型，将306只SD大鼠随机分成3组:假手术组、二氮嗪组和模型组。分别在缺血1 h后再灌注2、6、12h及1、2、3、7 d断头取脑，对脑组织行含水量检测，并采用免疫组织化学技术检测脑组织NR1表达情况。 结果 假手术组脑组织含水量明显低于二氮嗪组和模型组，二氮嗪组低于模型组，模型组和二氮嗪组脑组织含水量在12h开始升高、1d达高峰、3d基本恢复正常，模型组和二氮嗪组NR1均在2h开始升高、1d达到高峰、7d后基本达到正常水平，但二氮嗪组NR1表达水平在2、6、12h及1、2d明显低于模型组，且两组NR1表达水平均高于假手术组。 结论 二氮嗪预处理对深低温缺血再灌注大鼠具有脑保护作用，其作用机制可能是通过下调脑组织NR1的表达来实现。
【关键词】 深低温;脑缺血再灌注;二氮嗪;脑保护;NR1表达;大鼠
脑缺血再灌注损伤及其机制十分复杂，至今尚不完全清楚。脑缺血再灌注损伤包括神经细胞坏死和凋 亡两个方面，其中线粒体ATP敏感性钾通道被认为是关键环节之一［1］。二氮嗪是线粒体ATP依赖性钾离子通道开放剂，已广泛应用于缺血再灌注心肌保护方面的研究，而对脑保护方面的研究相对较少。N-甲基天冬氨酸受体（NMDAR）是目前研究最为深入的兴奋 性氨基酸（EAA）受体之一，是一种离子型EAA受体。目前已证实，NMDAR是由NR1、NR2A～2D 5种亚单位组成的异聚体。其中NR1亚单位是NMDAR的功 能单位，NR2是其调节单位，只有和NR1组合才表现出活性。NR1基因紊乱就会使NMDAR的活性丧失。EAA的毒性是通过受体活性改变而发挥作用，缺氧缺血能影响NMDAR的数量和功能，诱导和加强NR1 的表达，上调NMDAR的数量。基于上述研究背景，本试验主要采用脑缺血再灌注大鼠模型，观察二氮嗪预处理对脑缺血再灌注损伤后脑含水量、形态学及NR1的表达变化来探讨二氮嗪对深低温缺血再灌注大鼠是否具有脑保护作用及其可能的机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物
成年健康SD大鼠306只，雌雄不限，体重200～ 250 g，由南京市儿童医院实验动物中心提供。动物饲 养与实验均符合我国卫生部《医学实验动物管理实施 细则（1998）》的要求。
1.2 主要仪器与试剂
水合氯醛（南京市儿童医院提供）、二氮嗪（美国Sigma公司）、NR1（Santa Cruz公司），羊抗兔即用型 SABC免疫组化检测试剂盒SA1022（武汉博士德公司）、DAB显色剂（武汉博士德公司）、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、荧光倒置显微镜（德国蔡司）、801图像分析 系统（江苏捷达）。
1.3 动物模型建立
用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，完全麻醉后固定大鼠四肢及头部。剃除颈部及腹股沟处鼠毛，碘伏消毒皮肤，酒精脱碘后，纵行剪开颈部皮肤，从正中打开颈外肌层，分别向左右沿颈外斜肌间隙分离筋膜，找到颈总动脉，从伴行的神经旁游离出动脉并套上丝线，用纱布盖好切口;用涂有石蜡油的温度计插入肛门3cm ，探测大鼠的体温（通过对大鼠深部体温检测来估计脑部的温度）。将鼠置冰盒并用冰块袋包埋大鼠行物理降温。当体温降至21℃时停止降温，用动脉夹阻 断两侧颈总动脉，使体温维持在（21±1） ℃，60min 后恢复颈总动脉血流。用电吹风给大鼠复温，每分钟体 温恢复不超过0.5℃，大约在0.5h内将体温恢复到32℃，再将大鼠放入35℃早产儿孵育箱复温，在2h内将体温恢复到37.5 ℃体温，维持正常体温4h后放置室温下正常饲养。
1.4 动物分组
①假手术组:102只，不夹闭左右颈总动脉，不注 射药物;②模型组:102只，术前腹腔内注射等体积生理盐水;③二氮嗪组:102只，术前腹腔内注射二氮嗪5mg · kg-1。模型组和二氮嗪组再分为缺血60 min再灌注后2、6、12h和1、2、3、7d共7个小组，假手术组分为术后2、6、12 h和1、2、3、7d共7个小组，每个小组 16只，其中6只用于脑组织含水量测定，10只用于石 蜡包埋后行免疫组化检测。
1.5 脑组织含水量测定
待测含水量的脑组织标本测定其湿质量及在电热 恒温干燥箱中100 ℃48h的干质量，以计算含水量。公式如下:含水量=（湿质量-干质量）/湿质量× 100%。
1.6 脑组织中NMDAR1的表达情况
大鼠脑组织予多聚甲醛灌注、固定，完毕后断头取脑，脑组织采用4%多聚甲醛溶液再固定约24h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。步骤如下:切片常规脱蜡，3%H2O2灭活内 源性酶，热修复抗原，5%BSA封闭，加入兔抗大鼠NMDAR1多克隆抗体（1∶100）4℃过夜，再滴加生物素化山羊抗兔IgG室温保存20 min，SABC室温20min，滴加新鲜配置的DAB显色液进行显色，苏木素复染，常规脱水，透明，中性树胶封片后，光镜下观察。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值，每张切片随机选择4个高倍视野（400×）观察并取其平均值，以灰度值来表示NR1的表达水平，灰度值越高，免疫组织化学染色越浅，NR1表达越低。
1.7 统计学处理
所有实验数据用 x-±s 表示，采用SPSS11.0统计软件进行析因设计资料的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，两两组间均数之间比较采用SNK检验，相同时间点两组间比较用 t 检验，P <0.05表示差异具有统计学意义。
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