静电纺多糖纳米纤维特性及其再生医学应用进展
中图分类号 TQ340.64 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）11-0019-05
Properties of Electrospun Polysaccharide Nanofiber and Application in Regenerative Medicine
Li Xin et al.
（College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）
Abstract：Electrospining is an effective method for preparing polymer nanofibers. Electrospun nanofibers possess excellent characteristic such as good biocompatibility，controllable biodegradability，large specific surface area and high porosity. So it has shown promise in the fields of regenerative medicine. The research progress of several major natural polymer electrospun fibers such as chitosan，konjac glucomannan，natural cellulose，hyaluronic acid and its derivatives，etc. as well as important applications in biomedical field were mainly discussed.
Key words：Electrospinning；Polysaccharide；Regenerative medicine
再生?t学利用生物学及工程学的理论方法创造已经丢失或功能损害的组织和器官，使其具备正常组织和器官的机构和功能。再生医学探索领域包括通过移植细胞悬浮体或聚合体来代替受损组织；生产能够替代天然组织的生物化人工组织或器官的植入；通过药物手段对损伤组织进行再生诱导。而静电纺丝制备的纳米纤维直径小于细胞，可模拟天然细胞外基质的结构和生物功能，是理想的细胞粘附增殖基质；此外，其天然的电纺原料具有很好的生物相容性及可降解性，可作为载体进入人体，并容易被吸收；纳米纤维与人的多数组织、器官在形式和结构上类似，使其有应用于组织器官的潜力。静电纺丝纳米纤维还具有比表面积大、孔隙率高等特性，因此在再生医学领域引起了很大的关注，并已经在药物缓释控释载体、组织工程支架以及创伤辅料等方面得到了很好的应用。
1 静电纺丝原理
静电纺丝是一种连续制备纳米纤维的高效技术。主要装置包括3个部分：供给静电压的高压电源装置、装填纺丝液针管的喷丝装置和接地的收集装置。高压电源可以提供1～30kV的直流电，高压电源使液体带电并被极化，最终从泰勒锥喷出形成射流。喷丝装置是一个注射管，纺丝液装在带有针头的管中，溶液多为聚合物溶液或是熔融状态的熔体。收集装置一般为接地的金属板，此外，还有a、b等接收形式，因此，使其收集到多样的纤维排列方式[1]。其制备纳米纤维过程如图1所示。静电纺丝是让具有一定程度分子缠结的聚合物溶液在高压静电的作用下使表面电荷斥力超过表面张力，产生泰勒锥并高速喷射出聚合物射流。纺丝溶液的粘度是纺丝纤维形成的关键：若粘度太小，在电场力的作用下会分离成小液滴；而射流粘度太高时，由于相邻单元的电斥力致使射流侧向凸出，几乎不能制得纤维[2]。因此，可以通过使用合适的溶剂、调控溶液浓度等方式来提高静电纺丝的效果。相比其他制备纳米纤维的方法，如自组装法、相分离法、模板合成法，静电纺丝具有设备简单、可纺物质种类多、成本低、技术可控等优点。由于静电纺丝溶液中溶有很多功能性物质，且所得的纳米材料具有高比表面积、高孔隙率、良好韧性及轻便的特点[3]。因此具有广泛的用途，可望应用于生物医学领域。
当前静电纺丝聚合物材料包括合成的、天然的以及二者的混合物。相比于合成聚合物原料（聚乙烯、聚丙烯及芳香族聚酯等），天然聚合物（如多糖、蛋白质、脂类等）具有低毒性、优良的生物相容性、可再生及生物降解性[4]。最近研究电纺多糖及其衍生物的数量增加，然而关于多糖的加工性的困难（例如：差溶解度和高表面张力）限制了其应用。在这篇综述中，总结了壳聚糖、魔芋葡甘聚糖、纤维素、透明质酸等多糖的特征，以及目前正在使用或者有潜力应用的静电纺丝纳米纤维。
2 静电纺多糖的研究
多糖是单糖的均聚物或共聚物，多糖可以在多种生物中发现，包括微生物来源（例如葡聚糖）、动物来源（如壳聚糖和透明质酸）和植物来源（如藻酸盐、纤维素和淀粉）。多糖的化学结构、化学成分、分子重量和离子性质多种多样有助于其功能和生物活性的展现[5]。迄今为止已经进行了许多研究，如电纺丝多糖及其衍生物制造的纳米纤维在再生医学中具有潜在的应用。
2.1 壳聚糖 壳聚糖（CS）是天然生物大分子甲壳素通过脱乙酰而得到的衍生物。它由（1，4）连接的N-乙酰基-β-D-葡糖胺组成，是世界上第二大天然聚合物。它不仅具有优良的生物可降解性、生物相容性和生物黏附性，而且易加工成为膜状物或多孔支架[6]。甲壳素类纤维独特的生物特性具体表现为组织亲和性、无免疫抗原性、促愈合性、抑菌性等，因而成为重要的生物医学材料之一。 Liang等[7]发现带负电的磷黄病毒（PV）和带正电荷的壳聚糖（CS）通过逐层（LBL）自组装技术交替沉积在带负电荷的纤维素垫上。通过扫描电子显微镜（SEM）观察LBL膜涂层的形貌。之后通过在模拟体液（SBF）溶液中温育不同时间的纤维垫进行体外仿生矿化。扫描电子显微镜（SEM），X射线光电子能谱（XPS）和X射线衍射（XRD）用于表征支架上沉积的矿物相的形态和结构。细胞培养实验表明，具有LBL结构膜的支架对于MC3T3-E1细胞具有良好的细胞相容性。同时，细胞增殖受沉积层的数量和最外层的组成的影响。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和SEM成像显示MC3T3-E1细胞在生物复合支架表面对细胞粘附和扩散具有良好性能。因此，CS/PV纳米纤维毡有望应用于生物医学。
杨文静[8]以静电纺丝的方法制备了CS/PCL血管支架。采用SEM和电子万能试验机检测了该支架的结构和力学性能，将内皮祖细胞（EPCs）与该支架膜复合培养，评估了该血管支架维持细胞黏附、繁殖和分化的能力。SEM表征和力学性能测试表明CS/PCL支架具有和天然细胞外基质/纳米结构相似的多孔结构，当CS与PCL的质量比为0.5时，静电纺丝所制备CS/PCL血管弹性变性能力较强。此外，CS/PCL具有CS和PCL的共同优点，具有良好的细胞相容性，表面多孔结构有利于细胞黏附生长。这为组织工程内皮种子细胞的种植提供一种合适支架。
陈岚[9]尝试静电纺丝法制备类人胶原蛋白（Human-like collagen，HLC）-壳聚糖（chitosan）纳米纤维薄膜，通过加入大分子量的聚环氧乙烷（PEO）改善了HLC与chitosan的纺丝性质，使其可纺。形貌均一的类人胶原蛋白/壳聚糖复合材料克服了纯组分材料降解过快的缺陷，能够有效促进细胞贴附与增殖，组织相容性良好。
2.2 魔芋葡甘露聚糖 魔芋葡甘露聚糖是一种从魔芋块茎中提取的天然高分子聚合物，具有生物相容性、可降解性和水溶性，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。有一定的黏度，符合静电纺丝对纺丝溶液的基本要求。因其生物降解性、可再生性和低成本得到了?V泛的关注。魔芋葡甘露聚糖（KGM）由α-1，4的D甘露糖和D-葡萄糖组成，比例为1.6∶1，每12或18个重复单元含有乙酰基[10]。同时，KGM是一种良好的膳食纤维，具有预防和治疗高血压、高血脂、心血管等疾病的药理作用，也可以作为医用材料用于医学。正是因为静电纺丝得到的纳米材料具有很好的生物相容性和结构相容性[11]，已经在组织工程支架、创伤修复、药物释放等方面得到了应用。
目前KGM的纳米技术研究大多有关于其结构或KGM与其他材料的复合物。由于缺乏有机物溶剂，许多天然聚合物不能从其水溶液中静电纺丝。Huarong Nie[12]等在研究中发现，通过电纺水溶液制成的魔芋葡甘聚糖（KGM）纤维支架的平均直径在150nm至300nm范围内。在没有任何化学交联剂使用情况下，KGM水溶液通过低浓度NaOH稀释处理后，实现脱乙酰基，提高了KGM纤维支架的稳定性。同时，KGM/壳聚糖双组分膜比较容易从稀酸溶液中获得，随着壳聚糖含量的增加，平均纤维直径从350nm降低到180nm。关于生物学特性的研究表明纳米纤维支架为骨髓基质细胞提供更合适的空间，添加KGM可以提高壳聚糖材料的生物相容性。预计KGM及其复合纳米纤维支架将具有潜在应用于一种新型生物医学材料。
王静[13]将羟基磷灰石、魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠三者复合，制备可用于骨组织工程的三维多孔骨组织工程支架材料，并对复合支架进行了体外干细胞相容性实验，探讨复合支架的使用性能。景森[14]发现，可以在 KGM 材料中引入一些具有生物特异性识别能力的多肽（如缩氨酸），或分子识别介质（如整连蛋白）以上实验研究结果表明所制备的复合支架具有一定的降解性、无毒性和良好的生物相容性，有望用作骨支架材料。
2.3 纤维素 纤维素由（1，4）连接的β-D-葡萄糖单元组成。由于其作为丰富的可再生资源和良好的生物降解性和生物系统相容性引起了很大的关注。纤维素的材料已经广泛应用于制药和生物学领域，包括用作吸附珠、过滤器、人造组织皮肤和防化服[15]。然而纤维素的加工受其在有机溶剂中有限的溶解度而限制。纤维素比淀粉更容易结晶，纤维素需要320℃和25MPa压力才能在水中变成无定形。
纤维素不熔化，因此必须从溶液中加工。直接溶解纤维素的几种溶剂已被研究并用于静电纺丝，包括N-甲基吗啉N-氧化物/水（NMMO/水）和氯化锂/二甲基乙酰（LiCl/DMAc）。最近已经有离子液体用于制造电纺纤维素纳米纤维，然而这些溶剂的挥发性低，因此不能完全在静电纺丝过程中蒸发。此外，电纺丝温度必须升高到溶剂熔融温度以上（例如NMMO/水约85℃）。对于LiCl/DMAc溶剂系统，难以完全除去锂或静电纺丝后凝结氯离子。纤维素衍生物因其增强纤维素的溶解度从而提高其电纺丝性能已被广泛利用。纤维素衍生物可以容易地电纺成纤维，然后通过水或乙醇水解转化为纤维素。纤维素用于静电纺丝的衍生物包括醋酸纤维素（CA），三乙酸纤维素（CTA），羟丙基纤维素（HPC），乙基纤维素（EC），甲基纤维素（MC）和乙基氰乙基纤维素（E-CEC）。电纺纤维素纳米纤维基质已被用作为亲和力或阻隔膜，类似于膀胱的三维结构基质抗菌膜以及酶固定膜，药物输送膜[16-17]。
超细氧化纤维素（OC）基质是通过静电纺丝CA产生的超细纤维素的氧化随后进行乙酰化制备的。Khil等[18]人通过使用不同含量NO2氧化剂制备了具有不同羧基的OC基体。在PBS中孵育4d内，OC基质的重量损失大于90%。将电纺CA纳米纤维膜用高碘酸纳氧化产生醛基，共价连接其上含有IgG结合结构域的蛋白质A/G配体[19]。该膜为小规模快速纯化抗体提供了有用的工具。张等人[20]也用二乙基氨基乙基官能化的纳米纤维膜（DEAE）组作为弱阴离子交换组制造再生纤维素，并评价他们生物分离应用的潜力。DEAE功能化纤维素纳米纤维具有增强牛血清蛋白（BSA）的粘合能力。直径超细的纤维素通过静电纺丝和碱性水解制备100nm的CA。电纺丝纳米纤维的表面通过与PEG二酰氯反应被激活，然后使用简单的碳二亚胺化学共价结合脂肪酶。结合的脂肪酶在升高的温度下显示出比游离脂肪酶更高的催化活性，在60和70℃下高至8～10倍。 来自纤维素及其衍生物的电纺丝纳米纤维通过将功能性化合物（例如药物）掺入纺丝溶液而被官能化。通过向丙酮/水（80/20，w/w）中的CA溶液中加入硝酸银制备抗微生物CA纳米纤维膜。随后通过用UV光照射电纺纤维将银离子光还原成银纳米颗粒。颗粒均匀分散在纤维上表面，其粒度范围为10～20nm。CA含有银纳米颗粒的纤维对金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，大肠杆菌和铜绿假单胞菌显示非常强的抗微生物活性。具有杀菌性能的纳米纤维也由静电纺制含有氯己定（CHX）的CA溶液杀菌剂和有机钛酸酯Tyzor TE（TTE）作为交联剂制备的[21]。所得纤维基质由于CHX固定在纤维上及未释放结合而在抑制区内，因此在接触时表现出对表皮葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌性能。
2.4 透明质酸 透明质酸（HA）是一种线性多糖，由（1，4）连接的α-D-葡萄糖酸的交替二单元和（1，3）连接的β-N-乙酰基-D-葡萄糖胺组成。HA是结缔组织（ECM）的主要成分，具有重要的生物学功能[22]。由于优异的生物相容性和生物降解性，HA及其衍生物已被广泛应用生物医学领域包括组织工程支架，伤口敷料，药物输送系统和植入材料。
作为天然ECM的主要组成部分，类似于藻酸盐，电解HA水溶液是非常困难的，因为HA水溶液的粘度和表面张力异常高从而阻碍静电纺丝过程。另外，由于静电纺丝时溶剂的蒸发不充分，HA的强保水能力导致电纺丝纳米纤维在集电体上融合。只有在吹制辅助静电纺丝（电喷吹系统）的发展之后，才能从水溶液中将HA制成纳米纤维膜[23]。使用DMF/水制造HA纳米纤维混合物（平均直径=200nm），显著地降低了表面张力，而不改变HA溶液的粘度。HA/明胶纳米纤维基质也可以通过这种方法生产（平均直径=190～500nm）。HA通过与明胶，PEO和玉米蛋白混合而电纺丝。添加HA提高明胶水溶液形成明胶/HA纳米纤维的电纺丝能力。一系列玉米蛋白/HA混合纤维膜与亚甲基二苯交联制二异氰酸酯（MDI），其混合纤维平均直径随着玉米蛋白含量的增加而增加[24]。基于HA的纳米纤维膜已经非常有吸引力作为仿生组织工程支架，伤口愈合材料，和药物输送系统。所以为了模仿天然ECM的架构使用硫醇化-HA衍生物（例如：3，3-二硫代双（丙酰二酰肼）改性透明质酸；HADTPH）电纺丝形成纳米纤维基质。NIH3T3成纤维细胞连接到基质上在基质内扩展树突形态，这表明HA-DTPH纳米纤维在细胞包封和组织再生基质中的潜在应用[25]。
3 总结
电纺多糖纳米纤维在许多生物医学应用中具有很大的潜力，包括再生医学。电纺多糖纳米纤维的未来关键挑战可能包括选择适当多糖、使用混合溶剂、各种衍生物的合成，天然或杂化物合成聚合物，核-壳结构、鼓泡电纺丝和微/纳米纤维复合材料的制造。在这篇文献中，总结了目前正在使用的多糖的一般特征及其静电纺丝在生物医学应用。通常使用较多的多糖是葡聚糖，纤维素，透明质酸，壳聚糖，淀粉[26]。尽管在许多生物医学应用中大多数多糖静电纺丝是有用的，但电纺丝仍然存在要克服的局限性。特别是多糖有限的溶解度，如纤维素。已经报道了各种各样提高溶解度的方法，包括衍生物的合成和混合溶剂体系的使用。由于固有的高分子量引起的高粘度也会导致一些电纺丝多糖电纺丝能力差，如壳聚糖和透明质酸。这些可以通过改变其它聚合物的共混和溶剂组成比来克服问题。
天然存在的多糖具有生物兼容和安全性因此应用于生物医学。然而，改善电纺丝纳米纤维的表面功能和生物活性分子对于特定的生物医学可能是非常重要的应用程序。表面化学，微观结构和结构化纳米纤维基质显著影响细胞粘附，增殖和分化。与随机取向的纳米纤维相比，排列的纳米纤维诱导创伤愈合过程中的神经突生长和增强皮肤细胞迁移[27]。此外，固定的生化因子（如可溶性因子）显著促进神经突生长。电纺丝纳米纤维基质通过氧或氨等离子体处理进行化学修饰，与未处理的基质相比，接种到等离子体处理的基质上的成纤维细胞的粘附和增殖有明显改善。制备用于再生医学中各种应用的多糖的电纺微/纳米纤维复合材料也是具有挑战性的，因为纳米纤维基质既不为基质内的细胞迁移提供足够的空间，也不能附着在?胞的有效点。因此，研究了由微纤维和纳米纤维组成的相同构造的合成聚合物的复合材料[28]。另外，电纺丝的关键问题是再生医学中的多糖纳米纤维可能需要更多的动物研究，通过材料科学家和临床医生协作可以取得快速进展。
