逐步回归分析方法研究影响山楂叶颗粒溶出行为的关键颗粒物理特性参数
[Abstract] The purpose of this study was to investigate the effect of key physical properties of hawthorn leaf granule on its dissolution behavior. Hawthorn leaves extract was utilized as a model drug. The extract was mixed with microcrystalline cellulose or starch with the same ratio by using different methods. Appropriate amount of lubricant and disintegrating agent was added into part of the mixed powder， and then the granules were prepared by using extrusion granulation and high shear granulation. The granules dissolution behavior was evaluated by using equilibrium dissolution quantity and dissolution rate constant of the hypericin as the indicators. Then the effect of physical properties on dissolution behavior was analyzed through the stepwise regression analysis method. The equilibrium dissolution quantity of hypericin and adsorption heat constant in hawthorn leaves were positively correlated with the monolayer adsorption capacity and negatively correlated with the moisture absorption rate constant. The dissolution rate constants were decreased with the increase of Hausner rate， monolayer adsorption capacity and adsorption heat constant， and were increased with the increase of Carr index and specific surface area. Adsorption heat constant， monolayer adsorption capacity， moisture absorption rate constant， Carr index and specific surface area were the key physical properties of hawthorn leaf granule to affect its dissolution behavior.
[Key words] stepwise regression analysis method； hawthorn leaves； granule； physical properties； equilibrium dissolution quantity； dissolution rate constant
溶出度是药物制剂质量控制的一个重要指标[1]。目前有较多通过改变辅料和颗粒尺寸提高颗粒剂溶出度的文献报道[2-4]，较少见到系统性地报道颗粒物理特性参数影响颗粒溶出行为的文献。由于颗粒的溶出行为不仅受颗粒物理性质的影响，还受到颗粒的化学组成、即颗粒处方和制备工艺等多方面的影响，而提取溶剂会改变制剂的处方组成，导致目标成分的微观化学环境不同，因此，对不同溶剂提取的提取物中溶解度不同的成分，影响颗粒溶出行为的关键颗粒物理性质可能不完全相同，故课题组在研究并报道了影响穿心莲（85%乙醇提取物）溶出行为的关键颗粒物理特性参数后[5]，进一步以山楂叶（50%乙醇提取物）为模型药，运用逐步回归分析方法，探究影响山楂叶溶出行为的关键颗粒物理特性参数。
1 材料
OPD-8喷雾干燥设备（上海大川原干燥设备有限公司），YF-118高速粉碎机（瑞安永历制药机械有限公司），VH-5混合器（吉林市中诚机械厂），HLSH2-6型湿法混合制粒机（北京航空制造研究所），YK-60型摇摆式制粒?C（吉林市中诚制药机械厂），标准筛（长沙市思科仪器纱筛厂），Mastersizer 2000 激光粒度测定仪（英国Malvern公司），TriStar3000 全自动比表面积及孔隙度测定仪（美国Micromeritics公司），TG328A 1/10万电子天平（德国Startorius公司），ZRS-8G智能溶出仪（天大天发科技有限公司），Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。 山楂叶药材（亳州市京皖中药饮片厂，批号130202），金丝桃苷（中国食品药品检定研究院，批号111521-201205），微晶纤维素（MCC PH101，安徽山河药用辅料股份有限公司，批号120805），可溶性淀粉（安徽山河药用辅料股份有限公司，批号120801），交联聚维酮（安徽山河药用辅料股份有限公司，批号P12051008），硬脂酸镁（国药集团化学试剂有限公司，批号20120302），微粉硅胶（Aerosil 300 pharma，德国Evonik公司，批号3152021419），冰醋酸（西陇化工股份有限公司，批号20140825），磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司，批号20140214），色谱纯甲醇（美国Tedia公司，批号14075085），乙腈（美国Tedia公司，批号13125057）。
2 方法
2.1 混合粉体及颗粒的制备
2.1.1 山楂叶提取液的制备
取山楂叶药材分别加10，8倍量体积分数为50%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并滤液并浓缩。
2.1.2 山楂叶混合粉体的制备
2.1.2.1 工艺A 取浓缩至相对密度为1.20（60 ℃）的浓缩液置于真空干燥箱内（80 ℃，-0.1 MPa）干燥5 h，取干燥产物置于YF-118粉碎机中粉碎，粉碎产物过5号筛，记为A，按质量比1∶1分别与MCC和可溶性淀粉置于VH-5混合器（25 r?min-1）中混合30 min，得到混合粉体分别记为A-M-2，A-S-2。
2.1.2.2 工艺B 取浓缩至相对密度为1.05（60 ℃）浓缩液进行喷雾干燥（进风温度130 ℃，出风温度60 ℃，流速14.2 mL?min-1），干燥产物记为B，按质量比1∶1分别与MCC和可溶性淀粉置于VH-5混合器（25 r?min-1）中混合30 min，得到混合粉体分别记为B-M-2，B-S-2。
2.1.2.3 工艺C 取工艺A干燥产物按质量比1∶1分别与MCC和可溶性淀粉混合，后置于YF-118粉碎机中粉碎并过5号筛，得到的混合粉体分别记为C-M-2，C-S-2。
2.1.2.4 工艺D 按工艺A计算每克浓缩液相当干燥产物的量，取浓缩液按换算成干燥产物的量，以质量比1∶1分别与MCC和可溶性淀粉混合，置于真空干燥箱中干燥，再置于YF-118粉碎机中粉碎后过5号筛，得到的混合粉体分别记为D-M-2，D-S-2。
2.1.2.5 工艺E 取A-M-2加入润滑剂和崩解剂，按A-M-2质量百分比加入1%微粉硅胶、1%硬脂酸镁，混合均匀后得到的混合粉体分别记为Aer-1，Mgt-1；取Aer-1按A-M-2质量百分比加入3%的交联聚维酮，记为Are-1/PVPP-3；取Mgt-1按A-M-2质量百分比分别加入2%，3%，5%的交联聚维酮，记为Mgt-1/PVPP-2，Mgt-1/PVPP-3，Mgt-1/PVPP-5。
2.1.3 山楂叶颗粒的制备
取混合粉体，以75%乙醇为润湿剂，液固比为13%，分别采用摇摆挤压和高速搅拌湿法制粒（制粒锅2 L，剪切速率1 250 r?min-1，搅拌速率600 r?min-1，润湿剂加入速率22.5 mL?min-1，制粒时间为60 s），其中采用摇摆挤压制粒工艺记为EG，高速搅拌湿法制粒工艺记为HSG。
2.2 颗粒物理特性参数的测定
参照文献[5]测定颗粒的水分（MC）、松密度（BD）、振实密度（TD）、Carr指数（CI）、Hausner率（HR）、比表面积（SSA）、孔隙率（PV）、临界相对湿度（CHR）和引湿性，每个样品平行测试3次。以GAB模型[6]拟合吸湿性吸附等温线，计算得到单层吸附量（V）和吸附热常数（C1），以单指数模型拟合吸湿时间-吸湿量曲线得到吸湿速率常数（k）。
2.3 溶出度的测量
2.3.1 金丝桃苷含量测定方法学考察
2.3.1.1 色谱条件 Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-1.8%醋酸水（15∶85），流速1 mL?min-1，柱温30 ℃，进样量20 μL，检测波长363 nm。
2.3.1.2 线性关系考察 精密称取金丝桃苷对照品适量，配置成107.04 mg?L-1的甲醇溶液作为储备液。将储备液稀释，得到系类一定质量浓度的标准溶液，在上述色谱条件下分别进样10 μL，记录金丝桃苷的色谱峰面积。
2.3.1.3 精密度?验 取浓度为1.07，3.21，10.7 mg?L-1标准溶液，每个浓度样品平行进样6次，记录峰面积，考察方法的精密度。
2.3.1.4 稳定性试验 按含量测定项下制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，12，24 h测定金丝桃苷含量，考察溶液的稳定性。
2.3.1.5 重复性试验 制备供试品溶液6份进行测定金丝桃苷含量，考察方法的重复性。
2.3.1.6 加样回收率试验 取山楂叶颗粒，适量，研细，精密称取已知量的该粉末6份，精密加入适量金丝桃苷对照品，按含量测定项下操作，计算回收率。
2.3.2 含量测定
精密称取山楂叶颗粒约0.5 g置锥形瓶中，加50%乙醇250 mL，超声提取30 min，补足失重，取样后使用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样含测。
2.3.3 溶出度测定
按照《中国药典》2015年版小杯法测定溶出度，以250 mL pH 6.8磷酸缓冲液[7]为溶出介质，每个溶出杯中加入各约0.5 g样品，转速100 r?min-1，溶出介质温度（37±0.5） ℃，在规定时间点（3，6，9，12，15，20，30，45，60 min）分别取样1.5 mL，同时补足等量等温溶出介质，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，进行测定，记录峰面积，计算不同时间点山楂叶颗粒中金丝桃苷的累计溶出百分率。 2.4 ?w粒溶出行为参数的提取及统计分析
以累积溶出百分率为纵坐标，溶出时间为横坐标，绘制颗粒的累积溶出曲线，并运用单指数模型（公式1）对颗粒溶出行为进行拟合，得到颗粒平衡溶出量（f′）和溶出速率常数（k′）。再以f′和k′为因变量，2.2项所测得的颗粒物理特性参数为自变量，采用SAS JMP 9.0软件逐步回归分析法分析影响山楂叶颗粒溶出行为的关键颗粒物理特性参数。
y=f′×（1-e-k′×t）（1）
其中，y为各取样时间点金丝桃苷的累积溶出百分率，t为取样时间，f′为平衡溶出量，k′为溶出速率常数。
3 结果与讨论
3.1 金丝桃苷含量测定方法学考察
对已建立的金丝桃苷HPLC测定方法进行方法学考察。结果表明金丝桃苷在1.07～6.42 mg?L-1呈良好线性关系，回归方程为Y=19.66X-1.46，R2=0.999 6；精密度RSD 1.2%；稳定性试验RSD 1.3%；重复性试验为RSD 1.0%；加样回收率为101.3%，RSD 1.7%。结果表明该含量测定方法适用于颗粒中金丝桃苷含量的测定。
3.2 颗粒物理特性参数及溶出行为测定
颗粒物理特性参数测定结果见表1，颗粒溶出行为曲线见图1，2。在0～15 min，金丝桃苷溶出量急剧增加，随后变化缓慢，在60 min时已基本达到溶出平衡，因此在60 min时结束取样，单指数模型拟合颗粒的溶出行为结果见表2。
3.3 关键颗粒物理特性参数对颗粒溶出行为的影响
逐步回归模型结果的分析用Leverage Plot和Summary of fit表示[8-9]，具体表示方法参考文献[5]，回归分析结果分别见表3，图3和表4，图4。
3.3.1 关键颗粒物理特性参数对平衡溶出量的影响
由表3可知：影响山楂叶颗粒中金丝桃苷平衡溶出量的关键颗粒物理特性参数有C1，V和k，由图3和表3可知：f′与C1和V呈正相关，与k呈负相关。
C1为单层和多层间的吸附热常数。吸附热是用来测量吸附质与吸附剂表面的吸附中心结合的程度，而不是分子间的能量[10]，属吸湿热力学参数。吸附热越大，吸附越强，表明颗粒成分与水分的作用越强，因而溶出量越大。
V是指物料在吸湿过程中的单层吸附量。V越大，表明物料的单层水吸附量越大，同样表明颗粒成分与水分的作用越强，因而溶出量越大。
k是指物料在吸湿过程中的吸湿速率常数，属吸湿动力学参数。在相同湿度条件下，k越大，吸湿越快，表明扩散动力越大[11]，则颗粒物料表面产生的水蒸气分压必然越小，从而说明物料对水的亲和力小，因而溶出量越小。
3.3.2 关键颗粒物理特性参数对溶出速率常数的影响
由表4可知，影响山楂叶颗粒中金丝桃苷溶出速率常数k′的关键颗粒物理特性参数有CI，HR，SSA，V和C1；由图4和表4可知，k′与HR，V和C1呈负相关，与CI和SSA呈正相关。
溶出速率常数属动力学参数，影响溶出速率常数的主要因素除目标成分的溶解速度外，还有水分子向颗粒内部扩散速度、溶解的目标成分向颗粒外扩散的速度，V和C1增大，表明颗粒成分与水分的作用越强，整个颗粒能快速溶解，并在局部形成黏性较大的高浓度溶液环境，从而导致目标成分向外扩散的速度减慢，因而溶出速率常数k′与之呈负相关。
HR反应了物料粒子间的摩擦力，可预测物料的流动性，HR越大，则粒子间的内聚力越大[12]，粒子间的内聚力越大，则粒子与溶出介质的相对作用越小，故溶出速度减慢，因而，k′与之呈负相关。
CI是颗粒的Carr指数，反应的是物料在压缩过程中的流动性。在一定范围内，CI越大，粒子的粒径越小[13]，其表面积越大，越易于颗粒的溶出，故k′与之呈正相关。
SSA是比表面积，显然，比表面积越大，整个物料与溶出介质的接触面积越大，因而溶出速度越大，故k′与之呈正相关。
3.4 与影响穿心莲颗粒溶出行为的关键颗粒物理特性参数比较
前期研究报道了影响穿心莲颗粒中脱水穿心内酯溶出的关键因素有颗粒平均粒径、临界相对湿度、含水量、等体积平均径及孔隙率等[5]；而本文研究表明影响山楂叶颗粒中金丝桃苷溶出的关键因素有C1，V，k，HR，CI和SSA。显示影响溶出的关键物理性质随物料的不同而又明显差别。药物的溶出不仅受到颗粒物理性质的影响，还受到自身溶解性能、颗粒的化学组成等多种因素的影响，因而，对于不同提取溶剂中、溶解性能不同的药物，影响其溶出的关键物理性质可能不同。
4 结论
本实验以逐步回归分析方法研究影响颗粒溶出行为的关键颗粒物理特性参数，研究结果表明，①影响山楂叶颗粒溶出行为的关键颗粒物理特性参数有C1，V，k，HR，CI和SSA。②山楂叶颗粒中金丝桃苷的平衡溶出量（f′）与C1和V呈正相关，与k呈负相关；溶出速率常数（k′）与HR，V和C1呈负相关，与CI和SSA呈正相关。③影响溶出的关键物理性质随物料的不同可能不同。
