羊卵泡卵母细胞孤雌激活研究
2.3 6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响 6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果见表3。
表3 6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响
注：字母a，b，c和d，e，f表示0.01水平差异显著性检验，两组间有相同字母表示差异无显著性（P＞0.01）；字母a，b，c和d，e，h，k表示0.05水平差异显著性检验，两组间有相同字母表示差异无显著性（P＞0.05）
由表3的统计结果可以看出，成熟卵母细胞用6-DMAP孵育1h、3h卵裂率分别为20.00%和36.19%，显著低于激活5h（45.71%）、7h（48.57%）和9h（46.67%）三组（P<0.01）；5h、7h和9h三组之间差异无显著性（P＞0.05）。
成熟卵母细胞用6-DMAP孵育1h不能发育到囊胚；孵育3h囊胚率为5.71%，显著低于激活5h（12.38%）、7h（10.48%）和9h（7.62%）三组（P<0.01）；孵育5h和7h的囊胚率差异无显著性（P＞0.05），但显著高于孵育9h组（P<0.05）。
由此可见，在一定范围内（7h）成熟卵母细胞的卵裂率随与6-DMAP孵育时间延长而提高，时间低于3h卵裂率很低，高于7h卵裂率不再提高；对于囊胚率而言，与6-DMAP孵育时间太短不能发育到囊胚，高于5h囊胚率下降，因此卵母细胞激活后在6-DMAP中的孵育时间以5h左右为宜。
3 讨论
3.1 Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响 Ionomycin 是一种高效Ca2+载体，对卵母细胞激活非常有效，目前在哺乳动物卵母细胞的激活中得到广泛应用［1］。Ionomycin激活卵母细胞并不直接引起Ca2+的跨膜转运，而是动员细胞内的Ca2+，依次触发Ca2+内流［2］，激活的卵母细胞无原核形成，但有关研究证明Ionomycin与蛋白质磷酸化抑制剂6-DMAP联合作用可以有效的提高原核形成率［3］，卵母细胞用Ionomycin处理后立即用6-DMAP处理，可以得到高比例的原核形成率（76%）和囊胚发育率（21%）。
6-DMAP阻止蛋白质的磷酸化，抑制促成熟因子（MPF）和细胞静止因子（CSF）的活性，阻止第二极体的排放，MPF活性的下降导致卵母细胞减数分裂的恢复，从而激活卵母细胞［4］。
本实验比较了6-DMAP 在0.5mM、1.0mM、2.0mM和3.0mM下对羊孤雌激活卵母细胞卵裂率的影响，结果表明，用Ionomycin激活的卵母细胞，在2mM 6-DMAP内培养的卵母细胞的卵裂率最高，低浓度的6-DMAP由于不能彻底抑制蛋白质的磷酸化，因而不能充分激活卵母细胞。
3.2 乙醇与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响 乙醇是一种化学激活剂，它对卵母细胞的激活主要是通过水解细胞膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）产生1，4，5-三磷酸肌醇（IP3），从而诱发细胞内源Ca2+释放到细胞质，提高了细胞胞内的Ca2+浓度［5］。哺乳动物MII期卵母细胞在含有7%乙醇的培养液中培养5min，可以激活卵母细胞使其形成原核，甚至可以发育到囊胚［6］；乙醇对卵母细胞的激活无种间特异性，但在不同动物卵母细胞对乙醇激活的反应不同。
本实验比较了不同6-DMAP浓度对羊孤雌激活卵母细胞卵裂率的影响，结果表明，用7%乙醇激活的卵母细胞，同样在2mM 6-DMAP内培养的卵母细胞的卵裂率最高，这与Ionomycin激活的结果一致。
比较Ionomycin与乙醇对卵母细胞的激活效果，Ionomycin对羊卵母细胞的激活效果比乙醇好，但乙醇的适用性比Ionomycin好。
3.3 6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响 无论是Ionomycin还是乙醇，一切激活剂都会影响卵母细胞染色体形成，进而影响孤雌胚后期的发育［7］，6-DMAP激活卵母细胞主要通过抑制第二极体的排放，形成二倍体原核［8］。
激活剂对卵母细胞激活的时间直接影响卵母细胞染色体的状态，从而表现为卵裂率与囊胚率的差异。Van De Velde等（1999）用6-DMAP激活小鼠卵母细胞3.5h，其卵裂率与体外受精胚的卵裂率差异不显著，激活时间延长至6.5h，孤雌胚的发育率明显下降，染色体的异常形成率明显升高［7］；由此说明6-DMAP通过阻止染色体分开和抑制第二极体排放，诱发卵母细胞活化，延长6-DMAP作用时间会造成纺锤体微管的不可逆损伤，引起异常分裂和非正常倍数的染色体的形成，从而表现为囊胚率的下降。
本试验研究结果表明，成熟卵母细胞用6-DMAP孵育1h、3h卵裂率分别为20.00%和36.19%，显著低于激活5h（45.71%）、7h（48.57%）和9h（46.67%）（P<0.01）；5h、7h和9h三组之间差异无显著性（P＞0.05）。成熟卵母细胞用6-DMAP孵育1h不能发育到囊胚；孵育3h囊胚率为5.71%，显著低于激活5h（12.38%）、7h（10.48%）和9h（7.62%）（P<0.01）；孵育5h和7h的囊胚率差异无显著性（P＞0.05），但显著高于孵育9h组（P<0.05）。
由此可见，在一定范围内（7h）成熟卵母细胞的卵裂率随与6-DMAP孵育时间延长而提高，时间低于3h卵裂率很低，高于7h卵裂率不再提高；对于囊胚率而言，与6-DMAP孵育时间太短不能发育到囊胚，高于5h囊胚率下降，因此卵母细胞激活后在6-DMAP中的孵育时间以5h左右为宜。
4 结论
Ionomycin和乙醇都是较好的激活剂，二者与6-DMAP 协同作用激活卵母细胞时6-DMAP 的适宜浓度以2mM为宜，综合比较二者的激活效果，Ionomycin比乙醇激活效果好，但乙醇比Ionomycin简单便捷。
在卵母细胞孤雌激活过程中，6-DMAP对卵母细胞的孵育时间直接影响卵母细胞染色体的活动与状态，从而影响孤雌胚的发育，本研究认为以Ionomycin和乙醇为激活剂时，6-DMAP的孵育时间以5h为宜。
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