VPA解除Met对大鼠皮质神经元GAD表达的抑制
2 结果
2.1 培养细胞的观察 于种植完全培养液3天后，于倒置显微镜下观察可见大部分细胞贴壁，神经元约占据培养板面积的2/3 左右，胞体以呈椭圆形和三角形者占多数，部分细胞胞体为多角形，多数神经元长出2个以上的突起，并与邻近神经元的胞体或突起形成接触，90% 以上胶质细胞死亡浮起，表明大鼠皮质神经元的体外培养成功；分组继续培养6天后各组神经元胞体继续增大，突起长度及数量继续增加，基本铺满培养板，胶质细胞极少，表明在加入Met和VPA分组后大鼠皮质神经元生长正常。随机取20个视野(200×，0.44mm2/视野)，计数每个视野中胞体折光性好、长出突起、生长状态良好的细胞，比较各组的存活细胞数。结果列于表1，表明不同组别细胞存活数没有差别（P>0.05），说明Met在2mM的浓度范围内、VPA在0.5mM的浓度范围内均不影响神经元的生长。
表1 不同组别细胞存活数、GABA阳性细胞数及谷氨酸脱羧酶相对酶活性的比较 (x±s)
注:aF=0.13，P＞0.05；bF=1.41，P＞0.05；cF=57.807，P＜0.05，n=8
2.2 GABA能神经元细胞数的比较 用免疫细胞化学反应显示不同组别的细胞均主要是GABA能神经元(84%左右)。实验组免疫反应阳性的神经元所占比例与其他两组相比差异无显著性(数据见表1)。说明在下一步实验中裂解细胞获得的粗酶提取液三组均主要来源于GABA能神经元。
2.3 谷氨酸脱羧酶活性的测定 酶活性测定结果列于表1，可以看出空白组和VPA组酶活性没有差别，Met组的酶活性明显低于上两组。说明蛋氨酸抑制大鼠皮质神经元表达GAD，降低GABA的合成；VPA促进皮质神经元表达GAD，可以使被Met抑制的GAD恢复到正常水平。
3 讨论
培养细胞的观察表明不同组别细胞存活数没有差别，说明Met在2mM的浓度范围内、VPA在0.5mM的浓度范围内不影响神经元的生长。免疫细胞化学反应显示不同组别的细胞均主要是GABA能神经元，说明裂解细胞获得的粗酶提取液三组均主要来源于GABA能神经元，酶活性测定结果说明蛋氨酸抑制大鼠皮质神经元表达GAD，降低GABA的合成，VPA促进皮质神经元表达GAD，可以使被Met抑制的GAD恢复到正常水平。GABA系统的异常是精神分裂症的病理生理特点之一，神经递质GABA具有能使多巴（DA）向下调节的作用，还可以作用于中脑前叶及皮质DA能神经通路［6］。GABA是由GAD催化L-MSG裂解而生成的。GAD的表达受多种因素调节，其中启动子的CpG岛的胞嘧啶5′碳原子的甲基化修饰和组蛋白乙酰化修饰是其中的两种主要调控方式。
Met在体内可增加SAM的供给，而SAM的增加可以促进基因的甲基化修饰而引起GAD等基因表达降低。这可能是Met使SZ患者症状恶化的原因。Tremolizzo［2］在大鼠腹腔注射Met (6.6 mmol/kg 15天，1天2次)引起大鼠体内活性甲基供给体SAM增加，并且发现大鼠脑中GAD mRNAs显著减少，笔者通过原代培养技术培养大鼠皮质神经元，然后用Berthelot［4］ 反应测定不同组别的皮质神经元裂解液的相对酶活性。所得结果与Tremolizzo的结果相同，既Met 能抑制GAD基因表达，将使皮质神经元中GAD的相对酶活性降低。
2001年Christopher［3］发现VPA能抑制组蛋白去乙酰基酶（Histone Deacetylase，HDACs)的活性，组蛋白末端的乙酰化与转录激活相关，而去乙酰化与转录抑制相关。Francesca在大鼠腹膜内注射VPA(200ng/(kg·d)，30天)，然后用鼠基因组U34 Affymetrix寡聚核苷酸芯片（包含8799已知的探针）分析大鼠脑中基因的表达，发现有87种基因表达下调、34种基因表达上调［7］，被影响的基因产物参与多种调节通路和代谢途径。我们的研究表明VPA促进皮质神经元表达GAD，并且可以使被Met抑制的GAD恢复到正常水平。这也可能是联合使用VPA类药物治疗SZ能快速改善患者的症状的主要原因。
【参考文献】
1 Brune G G，Himwich H E. Effects of methionine loading on the behavior of schizophrenia patients. J Nerv Ment Dis，1962，134：447-450.
2 L Tremolizzo G，Carboni W B，Ruzicka C P，et al.An epigenetic mouse model for molecular and behavioral neuropathologies related to schizophrenia vulnerability.PNAS，2002，99 （26）：17095-17100.
3 Christopher J，Phiel F Z，Eric Y，et al. Histone deacetylase is a direct target of valproic Acid，a potent anticonvulsant，mood stabilizer，and teratogen.J Biol Chem，2001，276(39): 36734-36741.
4 许建军，江波，许时婴，等.比色法快速测定乳酸菌谷氨酸脱羧酶活力及其应用.微生物学通报，2004，31(2):66-71.
5 陈丽敏，陈晓春，林挺岩，等.大鼠皮质神经元的体外培养和纯化.福建医科大学学报，2002，36 （3 ）：239-241.
6 李华芳，林治光，顾牛范.γ-氨基丁酸与精神分裂症的治疗.上海精神医学，2000，12（增刊）:25－26.
7 Francesco Impagnatiello，Alessandro R. Guidotti，Christine Pesold，et al.A decrease of reelin expression as a putative vulnerability factor in schizophrenia . PNAS，1998，95（26）:15718-15723.
8 Francesca B，Jane M，Bella P M. Microarray analysis of rat brain gene expression after chronic administration of sodium valproate.Brain Research Bulletin，2005，65:331-338.
