冠心病痰瘀证与载脂蛋白E基因多态性关系的研究

作者：佚名

时间：2007-09-12

作者：欧阳涛，宋剑南，苗阳，林谦，牛晓红，金红，陈冰

【关键词】 ,冠心病

［摘要］目的：探讨冠心病（coronary heart disease, CHD）不同痰瘀证候与载脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）基因第4外显子多态性的关系。方法：选择符合条件的CHD痰证、瘀证、痰瘀互阻证和非痰非瘀证（其他证型）患者200例，另选100名健康志愿者作为对照。常规检测所有样品的血脂水平。提取全血DNA，用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism, PCRRFLP）技术检测ApoE基因型。采用SAS软件对基因多态性和痰瘀证候的辨证类型进行相关性分析。结果：（1）冠心病患者中ε4等位基因频率（19.5%）明显高于健康对照组（9.5%），具有统计学意义（P<0.05），其中尤以E 3/4基因型更为多见（P<0.01）。（2）携带ε4等位基因者的总胆固醇（total cholesterol, TC）、总甘油三酯（total triglycerides, TG）和低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol, LDLC）水平明显高于非携带者（P<0.01）。（3）痰证特别是E3/4基因型患者中E3/4型和ε4等位基因的频率明显高于血瘀证患者（P<0.05）。结论：ApoE ε4等位基因是冠心病的危险因素，携带此基因的患者与痰证关系较为密切，推测其可能是CHD痰证的主要易感基因之一。
　
　　［关键词］冠心病; 载脂蛋白E类; 基因多态性; 痰瘀证候

　　Study on relationship between polymorphism of apolipoprotein E gene and syndromes of phlegm and blood stasis in patients with coronary heart disease

　　　ABSTRACT Objective: To explore the relationship between polymorphism of apolipoprotein E (ApoE) exon 4 gene and different syndromes in patients with coronary heart disease (CHD). Methods: Two hundred patients with CHD were divided into four groups according to syndrome differentiation, including syndrome of phlegm (PS), syndrome of blood stasis (BSS), syndrome of phlegmblood stasis blocking (PBBS) and syndrome of nonphlegm and nonblood stasis (NPNBS). One hundred healthy volunteers were included in control group. Blood lipids were measured by routine examination. Total DNA of peripheral blood was extracted. ApoE genotypes were determined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) technique. All data were analyzed by SAS software. Results: (1)The occurrence rate of ε4 allele of ApoE in patients with CHD was 19.5%, significantly higher than 9.5% in the control group (P<0.05), and the E 3/4 genotype was especially more frequent (P<0.01). (2) The levels of total cholesterol (TC), total triglycerides (TG) and lowdensity lipoprotein cholesterol (LDLC) in patients with ε4 were higher than those in patients without ε4 (P<0.01). (3) The frequencies of ε4 allele and E3/4 genotype in patients with PS were significantly higher than those in patients with BSS (P<0.05). Conclusion: ApoE ε4 allele, especially E3/4 genotype, is the risk factor of CHD. There is a relatively close relationship between patients with ApoE ε4 allele and PS. It may be one of the main susceptible genes in CHD patients with PS.

　　KEY WORDS coronary heart disease; apolipoprotein E; gene polymorphism; syndrome of phlegm and blood stasis

　　载脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）作为脂蛋白的组成部分和功能蛋白，对血脂代谢起调节作用, 编码ApoE基因的变异是影响血浆胆固醇浓度的重要遗传因素之一。已有报道证实：不同遗传背景人群的ApoE的基因多态性通过影响脂质代谢而与冠心病(coronary heart disease, CHD)的发病密切相关［1~3］。证候是中医认识和治疗疾病的根本，冠心病患者的临床表现以血瘀证和痰瘀互阻证为多见［4］。本研究对冠心病不同证候的发生和ApoE基因多态性的相关性进行了探讨，现报道如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例纳入标准选择在北京西苑医院和北京东方医院就诊的心肌梗死患者、或经冠状动脉造影及介入治疗确诊为冠心病的患者，这些患者均符合1999年美国心脏病协会AHA/WHO公布的冠心病分型和诊断标准［5］。然后对这些患者进行中医辨证确定证候类型。痰证、血瘀证、痰瘀互阻证、气虚证、阳虚证、阴虚证、气滞证、寒凝证等参考国家技术监督局发布的《中医临床诊疗术语・证候部分》（国家标准GB/T16751.21997）。

　　1.2 病例排除标准半年内曾有严重创伤或重大手术者；肾病综合征，甲状腺功能减退症，急性肝胆疾病及糖尿病患者；服用药物影响血脂代谢的患者；正在使用影响血脂代谢药物的患者。

　　1.3 病例资料按上述标准纳入不同证候类型的冠心病患者共200例，其中男105例，女95例；平均年龄(63.6±5.8)岁；其中痰证20例（10%），瘀证79例（39.5%），痰瘀互阻证82例（41%），非痰非瘀证19例（9.5%）；身体质量指数（body mass index, BMI）为15.1～34.3 kg/m2。另选100名健康体检者作为对照组，其中男55名，女45名；平均年龄(62.1±7.8)岁；均无冠心病症状，常规心电图及超声心动图检查正常。以上样本人群均来自北京和河北地区，汉族，无血缘关系。所有病例均作标准基线问卷调查，结果记录于按临床流行病学要求设计的表格上。医师、患者和实验研究人员之间实行盲法。

　　1.4 材料

　　1.4.1 主要试剂血清总胆固醇（total cholesterol, TC）和总甘油三酯（total triglycerides, TG）测定试剂盒购自法国申能公司；高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein cholesterol, HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol, LDLC）测定试剂盒由日本第一化学药品株式会社提供；血脂测定多项质控物由卫生部临床检验中心提供；全血DNA纯化试剂盒（Wizard genomic DNA purification kit）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量Marker（PCR Marker和pBR322Hae Ⅲ Marker）以及限制性内切酶HhaI均购自美国Promega公司；丙烯酰胺和NN’甲叉双丙烯酰胺，均购自北京鼎国生物技术公司。

　　1.4.2 血样采集患者空腹12 h后，静脉抽取2 ml血样，乙二胺四乙酸抗凝，用于提取DNA。

　　1.4.3 引物根据Richard 等［6］设计引物，序列为P1：5’AACAACTGACCCCGGTGGCG 3’；P2：5’ ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC 3’，均由北京鼎国生物技术公司合成。

　　1.5 方法

　　1.5.1 血脂水平的测定测定TG采用胆固醇氧化酶过氧化物酶4氨基安替比林和酚法；测定TC采用脂蛋白脂肪酶甘油磷酸氧化酶过氧化物酶4氨基安替比林和酚法（GPOPAP酶法）；测定HDLC采用选择性抑制法；测定LDLC采用选择性反应法。致动脉粥样硬化指数（atherogenic index, AI）的计算公式为：AI=（TC－HDLC）/HDLC。

　　1.5.2 ApoE基因型的测定采用全血DNA纯化试剂盒提取全血DNA。按《现代心脏内科学》［5］中的条件扩增ApoE基因的目的片段。反应体系：10倍缓冲液2 μl，浓度为2 mmol/L的dNTPs 2 μl，二甲基亚砜2 μl，浓度为2 μmol/L的引物各0.25 μl，2 U Taq酶，DNA模板100～200 ng，总体积20 μl。循环条件：95 ℃预变性8 min，然后95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共35个循环后，72 ℃延伸8 min。经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）检验扩增结果。取10 μl PCR产物加入10倍酶切缓冲液2 μl，小牛血清0.2 μl，浓度为10 U/μl的HhaI 0.5μl，去离子水7.3 μl。37 ℃反应4 h。产物用15% PAGE检测其基因型。

　　1.5.3 样品测序随机选取各基因型的PCR产物送北京鼎国生物技术公司进行序列测定。

　　1.6 统计学方法所有资料均采用SAS软件包进行分析。等位基因频率计算采用频率记数法；基因型，基因分布频率及基因和证候的相关性分析用χ2检验。不同基因型之间血脂的均数比较采用单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 ApoE基因目的片段PCR扩增结果所有300例血样均获得了阳性扩增条带，目的片段分子量为292 bp。见图1。

　　2.2 PCR产物HhaI酶切分型结果在300例样品中共检测出6种ApoE基因型，分别为E 3/3、E 4/4、E 2/3、E 2/4、E 2/2、E 3/4型，等位基因分别为ε2、ε3和ε4。见图2。图3为E 4/4型的5’端正向测序结果扫描图。将所有结果与GeneBank中已知的ApoE基因第4外显子对应部分序列进行比对，多态性位点碱基吻合，分型结果准确。

　　2.3 ApoE基因型与等位基因频率分布 CHD患者中ApoE 3/4基因型和ApoE ε4等位基因频率明显高于健康对照组（P<0.01, P<0.05），OR(Odds Ratio, 优势比也称比值比)值为2.9924，采用MantelHaenszel方法算得95％的可信区间为［1.6508, 5.4242］，使用CochranMantelHaenszel法得到P值为0.0002，表明ε4变异基因和CHD发病显著相关。见表1。

　　2.4 ApoE基因多态性对血脂水平的影响分析携带和不携带ε4等位基因患者的血脂水平，结果显示携带ε4等位基因者TC、TG、LDLC和AI明显升高（P<0.05或P<0.01）；而HDLC降低，但无统计学差异。表明ε4等位基因具有“升高血脂”的作用，可加重动脉粥样硬化的程度和提高发病风险。见表2。

　　2.5 ApoE基因型与等位基因频率在不同证候中的分布 E 3/4基因型和ε4等位基因频率在痰证（syndrome of phlegm, PS）患者中明显高于瘀证（syndrome of blood stasis, BSS）患者(P<0.05)，而E 3/4基因型在非痰非瘀证患者（syndrome of nonphlegm and nonblood stasis, NPNBS）中的频率则明显高于瘀证和痰瘀互阻证（syndrome of phlegmblood stasis blocking, PBBS）患者(P<0.05)，但未见其在ε4等位基因频率间有统计学差异。见表3。

　　图1 ApoE基因第4外显子目的片段PCR扩增结果电泳图（略）

　　Fig 1 PCR amplification results of ApoE exon 4 target fragment

　　M: PCR marker; 1: PCR products; 2: PCR products

　　图2 ApoE基因第4外显子目的片段PCR产物的HhaI酶切分型结果电泳图（略）

　　Fig 2 HhaI RFLP results of ApoE exon 4 PCR products

　　M: pBR322Hae Ⅲ marker; 1: Genotype E 3/3; 2: Genotype E 2/3;3: Genotype E 2/4; 4: Genotype E 2/2; 5: Genotype E 3/4;6: Genotype E 4/4

　　图3 ApoE E 4/4基因型样品的DNA测序图谱（略）

　　Fig 3 Sequence mapping of genotype E 4/4 of ApoE

　　表1 ApoE基因型及等位基因频率分布（略）

　　Tab 1 Frequency distribution of ApoE exon 4 genotypes and alleles in CHD group and control group

　　*P<0.05, **P<0.01, vs control group

　　表 2 ε4等位基因对血脂水平的影响（略）

　　Tab 2 Comparison of serum lipid level between patients in CHD group with and without ε4 allele

　　*P<0.05, **P<0.01, vs E 2/2＋E 2/3＋E 3/3 group

　　表3 各证候组ApoE第4外显子基因型和等位基因频率分布（略）

　　Tab 3 Frequency distribution of apoE exon 4 genotypes and alleles in CHD patients with different syndromes

　　*P<0.05, vs PBBS group; △P<0.05, vs BSS group

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