川芎嗪对大鼠移植肝的保护作用
表1 再灌注不同时点AST、ALT、LDH含量的变化 （u/L，x±s）
注：A组AST、ALT、LDH含量分别为（82.78±5.60）u/L、（48.80±4.30）u/L、(564.83±30.66)u/L；与A组比较，△P＜0.01；与B组比较，#P＜0.01
2.4 各组Bcl-2、Bax表达辉度值变化 与A组比较，B、C组于肝移植缺血再灌注后0.5h、3h、6h Bcl-2表达显著性增加（P＜0.01），Bax表达显著性降低（P＜0.01）；与B组比较，C组0.5h、3h、6h Bcl-2表达显著性上调（P＜0.01），Bax表达差异无显著性；并且B、C组内各时点Bcl-2、Bax表达差异有非常显著性（P＜0.01），且每两个时点间q检验有显著性时效关系（24h与48h间例外）（见表2、图3～6）。
图3 B组再灌注后6h肝组织Bcl-2表达（×100）?
图4 C组再灌注后6h肝组织Bcl-2表达（×100）?
图5 B组再灌注后6h肝组织Bax表达（×100）
图6 C组再灌注后6h肝组织Bax表达（×100）?
表2 各组Bcl-2、Bax表达的辉度值变化 （/um2，x±s）
注：A组Bcl-2、Bax阴性对照值均为（153.09±1.61）/μm2；△与A组各时点Bcl-2值比较，P＜0.01，Bax值P＜0.01；#与B组各时点Bcl-2值比较，P＜0.01，Bax值P＞0.05
2.5 肝功能（AST、ALT、LDH）水平与Bcl-2、Bax表达的相关性 AST、ALT、LDH水平与Bcl-2的表达呈显著性负相关，r值分别为-0.39（P＜0.05）、-0.51（P＜0.01）、-0.52（P＜0.01）；AST、ALT、LDH水平与Bax的表达呈显著性正相关，r值分别为0.71、0.54、0.75，P＜0.01；AST、ALT、LDH水平与Bcl-2/Bax表达呈显著性负相关，r值分别为-0.73、-0.72、-0.86，P＜0.01。
3 讨论
肝移植术后肝原发性无功能是肝移植后死亡的主要原因，与肝移植低温保存再灌注损伤密切相关［5］，其中细胞凋亡在组织细胞的丢失和器官功能衰竭方面发挥着重要作用［6，7］。肝移植体从可逆到不可逆的转变反映了肝细胞的增殖、分化和细胞凋亡的精细平衡，基因调控是细胞凋亡的重要调控机制［8］。
Bcl-2基因家族是最受关注的基因之一，任何一个死亡启动子与Bcl-2或Bcl-XL形成异型二聚体时，细胞就可以避免发生凋亡［9］。Bcl-2蛋白是一种膜整合蛋白，主要分布在线粒体内膜细胞膜内表面、内质网、核膜等处，具有抑制凋亡的作用［10］。目前认为其抗凋亡的主要机制是：抑制细胞内织网钙库释放钙，维持细胞内钙的稳定；恢复线粒体膜电位和调制线粒体内外膜之间通透性转变孔（PTP），抑制线粒体释放促凋亡蛋白质如细胞色素C、凋亡蛋白激活因子（APAF-1）、凋亡诱导因子（AIF）等［11，12］；抑制Caspase如Caspase-9的激活，从而抑制细胞凋亡级联放大反应［13，14］；直接抗氧化，对抗氧化应激所致的细胞凋亡［15］；抑制凋亡蛋白Bax及Bak的细胞毒作用等。本实验结果显示移植肝对照组再灌注0.5h即出现Bcl-2表达增加，与假手术组比较差异有非常显著性（P<0.01），随再灌注时间延长，Bcl-2表达进行性降低，肝功能形态损害进行性加重，再灌注后6h最明显，提示移植肝在保存再灌注损伤中可能通过增加Bcl-2表达而抑制凋亡，但其作用是有限的，随着再灌注时间延长，其抑制作用逐渐减弱。TPP干预组Bcl-2表达比肝移植对照组显著性上调（P<0.01），肝功能形态损害明显减轻，提示TMP可能上调Bcl-2表达，进一步抑制凋亡而保护移植肝。
Bax为Bcl-2家族中的一员，与Bcl-2不同的是，Bax是促进凋亡。其机制可能是通过诱导Caspase的释放来实现的，而Caspase能激活来自线粒体的细胞色素C，因而可能对抗Bcl-2的抑制细胞凋亡作用［16，17］；Bax的过度表达还可以促进细胞因子缺乏介导的细胞凋亡。本实验发现Bax的表达在肝移植后，随着再灌注时间延长逐渐增加，以再灌注6h最明显，后又进行性下降，24h后基本恢复正常（与假手术组比较），提示移植肝保存再灌注期间可能激发Bax表达而促进细胞凋亡，TMP干预对Bax表达无明显影响。
综上所述，川芎嗪可以通过上调Bcl-2或Bcl-2/Bax表达而有效地减轻肝移植体的低温保存再灌注损伤，对供肝有保护作用。但其上调Bcl-2或Bcl-2/Bax表达的具体机制尚有待进一步研究。
【参考文献】
1 Kwan CY，Daniel EF.Inhibitor of vasoconstriction by tetramethylpyrazine:does it act by blocking voltage dependent Ca2+ channel? Cardiovasc Pharmacol，1990，15(1)：157-162.
2 李源，段红，王天成，等.川芎嗪对大鼠心肌细胞c-fos基因表达及凋亡的影响.心脏杂志，2000，12（3）：213-215.
3 Kamada N，Calne RY.Orthotopic liver transplantation in the rat technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage.Transplantation，1979，28(1)：47-50.
4 Delriviere L，Kamada N，Goto S，et al.Retransplantation of the liver in the rat.Microsurgery，1993，14(S)：416-419.
5 Yuxin C.Perfusion and cold injury play an important role in liver preservation.Transplantation Proceeding，1998，30(6)：3688-3691.
6 赵浩亮，裘法祖.肝脏低温保存再灌注损伤的分子机制.中华肝胆外科杂志，2000，6（4）：313-314.
7 Morgan J，Curran T.Role of influx in the of c-fos expression.Nature，1986，322(6079)：312-324.
8 张延龄.细胞凋亡与外科疾病.国外医学·外科学分册，2001，28（5）：269-271.
9 Yin XM，Oltvai ZN，Korsmeyer SJ，et al.BHI and BH2 domains of Bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with bax.Nature，1994，369(6478)：321-336.
10 Jacobon，MD，Burne JF，King MP，et al.Bcl-2 blocks apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA.Nature，1993 361(6410)：365-369.
11 Green DR，Reed JC.Mitochondria and apoptosis.Science，1998，281(5381)：1309-1312.
12 Kluck RM，Bossy Wetzel E，Green DR，et al.The release of cytochrome c from mitochondria：a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis.Science，1997，275(5303)：1129-1132.
13 Wolf BB.Suicidal tendencies：Apoptotic cell death by caspase family proteinases.J Biol Chem，1999，274(29)：20049-20052.
14 Kienle K，Rentsch M，Muller T，et al.Expression of Bcl-2 in liver grafts after adenoviral transfer improves survival following prolonged ischemia and reperfusion in rat liver transplantation.Transplant Proc，2005，37(1)：439-441.
15 Lee M，Hyun DH，Marshall KA，et al.Effect of overexpression of Bcl-2 on cell oxidative，nitric oxide production，antioxidant defenses，and the proteasome.Free Radic Biol Med，2001，31(12)：1550-1559.
16 Leng Y，Feng Y，Cao L，et al.Effects of droloxifene on apoptosis and Bax，Bcl-2 protein expression of luteal cells in pseudopregnant rats.Acta Pharmacol Sin，2001，22(2)：155-162.
17 汤礼军，田伏洲，忘雨，等.肝脏低温保存再灌注期间肝细胞凋亡与Bax基因相关性研究.中华实验外科杂志，2001，18（2）：144-146.
