胶原基纳米骨材料(nHAC)体内降解的实验研究
[中图分类号] R783 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）03（a）-0008-04
[Abstract] Objective To explore the degradation rate and bone repair effect of collagen nano bone material （nHAC） and evaluate its biological performance to provide experiment basis for the clinical application of nHAC in jaw defect reconstruction. Methods 18 SD mice were produced bone defects in lower jaw and were randomly selected one sideway into nHAC，the other sideway into control group.After operation，6 mice were respectively executed at 4，8，16 weeks.The degradation of material and repair situation of bone defect were observed. Results The volume and shape of implant materials in the jaw appeared obvious changes at 8 weeks and the volume and bone cavity further decreased at 16 weeks，but not completely healed.Histological observation： implantation nHAC group appeared obvious degradation at 8 weeks.Vascular and new bone tissue grew into material gap，and newly formed trabeculae grew into gap that informed after material degradation at 16 weeks.There were no obvious repair in control group. Conclusion This study has confirmed that nHAC is good for repair of bone repair.The material can degrade during observation term and can be replaced by new bone tissue.
[Key words] nHAC；Biocompatible；Degrade in the body；Bone regeneration
飞速发展的组织工程学通过构建出具有良好生物功能的组织替代物，并将其广泛用于修复和重建受损组织，恢复和改善机体功能中。骨组织工程学普遍使用支架扮演模板的角色，因此恰当地设计人工骨支架，使其立体结构类似人类骨质的三维结构，有利于细胞在其上粘附生长。目前，可生物降解的支架材料由于其能在体内生物降解，且产物无毒已被广泛应用于组织工程支架材料的研究。骨组织工程支架材料的生物学行为是影响其临床应用的主要因素，材料的孔径形状、大小、孔隙率及其组成成分均可影响其生物降解性与骨传导性。本实验采用体内植入、自体双侧比较的实验方法对胶原基纳米骨植入材料（nHAC）进行初步评价，结果显示此种人工骨材料具有骨修复效果与生物降解特性，为今后进一步的研究提供了实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1主要材料和仪器 10%水合氯醛（昆山市石浦年沙助剂厂，批号：H32022265），2%利多卡因（太极西南药业股份有限公司，批号：H50020308），青霉素钠（哈药集团制药总厂，批号：H23021438），生理盐水，中性福尔马林溶液，聚维酮碘液（杭州民生药业公司，批号：H33021572），手术外科器械盒，一次性无菌注射器、清创包、无菌敷料。
1.1.2 实验动物 成年SD（Sprague-Dawley）大鼠18只，许可证号：SYXK（川）2013-119，雌雄不限，体重230～300 g，由四川大学实验动物中心提供。适应性饲养1周。
1.1.3 实验材料 选择1 mm×1 mm×1 mm大小的正方体nHAC（紫外线消毒30 min）。
1.2 方法
腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，取仰卧位，将其固定于手术台上，下颌区备皮。局部注射适量2%利多卡因后，切开双侧下颌骨下缘皮肤、皮下组织、肌肉、骨膜，暴露下颌骨，用牙科低速手机在下颌颌骨两侧各制备1.5 mm×1.5 mm的长方形全层骨缺损，生理盐水冲洗缺损区，无菌棉球吸干，将实验用nHAC放入缺损区，空白对照组不作处理，咬肌复位到下颌骨，缝合外切口。 1.3 取材与观察
术后观察动物创口愈合情况。4、8、16周后将实验组大鼠处断头处死6只，截取双下颌骨，通过大体标本观察，并进行HE染色，观察骨形成与植入材料降解的情况。
2 结果
2.1实验动物的一般情况
各动物均术后4 h内清醒，有2只感染，被排除实验，后又补了2只。所有动物创口均愈合良好，无移植物排斥反应。
2.2 实验动物的大体观察
实验组动物4周时骨缺损区无明显缩小，可见植入的nHAC外形清晰，体积无明显变化（图1）；8周时各骨缺损区有所减小，缺损区中央部分由增生的结缔组织充填，边缘有骨质增生，仍可见nHAC材料，但外形已经发生改变（图2）；16周时骨缺损修复区面积缩小明显，骨缺损区已有明显愈合，植入的nHAC材料边缘与周边骨质有骨融合，与标准材料相比，植入骨内的材料降解明显，体积减小且边界不清（图3）。空白对照组16周时骨腔虽有缩小，但与实验组差距明显，且未出现明显的骨组织修复，仅由纤维组织充填（图4）。图中箭头处均为nHAC材料显示。
2.3 组织学观察
实验组8周时nHAC中有血管及软组织长入，可见多核巨噬细胞浸润，材料开始降解（图5）；16周时可见材料部分降解后形成的空隙，有较多新生骨小梁形成并长入nHAC降解的空隙之中（图6）。空白对照组骨缺损处无明显成骨，未出现明显骨组织修复，而是由纤维组织充填（图7）。
3 讨论
颌骨与牙槽骨缺损的治疗是口腔科的难题之一[1]。常用的治疗方法是自体或异体骨移植术，自体骨常取髂骨块、肋骨等，异体骨则取冻干骨段。但两种骨移植术各有其局限性，自体骨移植成骨活性好，但取骨量十分有限，不能满足临床需求，且对供骨区造成明显损伤；异体骨移植则存在成骨活性差、容易传播疾病等问题。随着骨组织工程研究的不断发展，人工骨应用于骨缺损修复的价值逐渐被人重视，理想的人工骨材料应该能逐渐降解并被新生骨所替代[2]。有研究表明，纳米级羟基磷灰石因晶体尺度与天然骨接近[3]，具有良好的理化及生物学性能[4]，但单一的羟基磷灰石机械性差，作为骨替代材料可靠性不高[5]，且在体液中很难吸收，从而限制了它的应用[6]。胶原为天然大分子物质，为结缔组织的主要成分，是制备骨组织工程材料的理想成分。nHAC由于这种材料是以去抗原的Ⅰ型胶原为支架，将矿物相为晶体尺寸纳米量级的羟基磷灰石与之复合，复合过程中将材料学与生物学特性相结合[7]，从微观结构上仿造天然骨，有很高的比表面积及足够的孔径、孔隙率[8]，这有助于骨系细胞的粘附、增殖及功能的发挥[9]，并且利于骨组织长入[10]，便于生物降解[11]。因此运用这种最为常用有效的检测方法――体内埋植实验对nHAC进行测试，可针对性地了解nHAC在骨腔中的生物学行为[12]。
本实验采用大鼠自体双侧下颌骨对照方法，尽管大鼠骨骼尺寸较小，但仍可进行钻孔、截断及内、外固定等操作，较适合骨缺损的研究[13]。随机选取一侧作为实验组，采用nHAC修复，另一侧作为空白对照组。在SD大鼠下颌骨上造成1.5 mm×1.5 mm以上的贯穿性骨缺损，符合骨移植的适应证[14]。实验结果证实了该材料具有良好的骨传导性与骨组织相容性。从大体标本观察：实验组16周时骨缺损植入区界限模糊，并伴大量骨痂形成；空白对照组骨缺损植入区界限清晰，周围少量骨痂形成，因为单纯材料植入时骨缺损修复依靠周围纤维结缔组织及血管的长入，而材料所具有的骨传导性能，可提供支架，使断端的骨以爬行替代的方式向缺损中心处生长。组织学观察：实验组8周时nHAC中有软组织与血管长入，并可见巨噬细胞浸润、吞噬植入材料，但未见炎症反应，说明材料已开始降解；16周时nHAC降解已较明显，可见较多新生骨小梁长入nHAC降解的空隙之中，因此该材料的体内降解是一个渐进过程，具备骨传导能力，一定程度上能促进骨腔愈合。研究表明，nHAC是一种较为理想的骨缺损修复材料，此种材料也为今后骨组织工程材料的发展与临床骨缺损的修复提供了一些新的思路[15]。
本实验结果也表明，由于使用的nHAC材料有一定的力学强度，降解较慢，所以到16周时骨缺损仍未完全愈合，故进一步完善nHAC材料的制备工艺，研制出在早期力学强度好，后期快速降解完全的材料则更能够满足修复颌面部骨缺损的要求。
