甲基强的松龙对深低温停循环大鼠脑保护作用的研究

【摘要】  目的 观察甲基强的松龙（MP）对深低温停循环（DHCA）大鼠脑N 甲基 D 天门冬氨酸受体R1（NMDAR1）表达的影响，探讨MP对DHCA大鼠脑保护作用的机制。 方法 制作大鼠DHCA模型。雄性SD大鼠175只，随机分为假手术组、DHCA模型组和MP处理组。观察DHCA 60 min，再灌注2、6、12 h及1、2、3、7 d时NMDAR1蛋白表达的变化以及脑组织超微结构变化。结果 免疫组化结果显示，DHCA模型组和MP处理组大鼠NMDAR1蛋白表达均升高，于1 d到达高峰，后逐渐降低，于再灌注7 d恢复至正常水平。MP处理组大鼠再灌注后2、6、12 h，1、2 d 5个时间点NMDAR1表 达明显低于模型组（P<0.01）。脑组织超微结构观察发现MP能抑制DHCA脑细胞凋亡。 结论 MP对DHCA大鼠脑 组织具有保护作用，其作用机制之一可能是与抑制NMDAR1蛋白表达有关。

【关键词】  深低温停循环;甲基强的松龙;N-甲基-D-天门冬氨酸受体R1;脑保护;蛋白表达

　　深低温停循环（deep hypothermic circulatory ar-  rest，DHCA）技术自上世纪50年代诞生以来，已广泛应用于复杂和严重的先天性心脏病及大血管手术中，但其可能并发脑损伤的问题尚未得到较好解决，DH-CA术后中枢神经系统的发病率高达4%～25%。DHCA手术后患者近期不同程度出现手足舞蹈症、抽搐，远期出现认知障碍，儿童出现智力发育障碍等神经系统并发症［1］。DHCA后脑组织缺血缺氧导致突触前兴奋性氨基酸（EAA）大量释放和再摄取减少，从而激活突触后N 甲基D 天门冬氨酸（NMDA）和α氨基 3羟基 5甲基4异戊丙酸（AMPA）受体，引起大量K+外流和Na+、Ca2+内流，造成渗透分解和Ca2+相关性损害。本实验通过观察甲基强的松龙（MP）对DHCA大鼠脑NMDA受体1（NMDAR1）蛋白表达的影响，以探讨其脑保护机制。   

　　1 材料与方法   

　　1.1 仪器与试剂 

　　早产儿培育箱、自制大鼠冰窝、水合氯醛（南京市儿童医院提供）、MP（美国辉瑞制药公司）、NMDA受  体R1 （Santa Cruz公司），羊抗兔即用型SABC免疫组化检测试剂盒SA1022（武汉博士德公司）、DAB显色剂（武汉博士德公司）、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、荧光倒置显微镜（德国蔡司）、801图像分析系统（江苏  捷达）。  

　　1.2 动物 

　　成年健康雄性普通级SD大鼠（南京医科大学实验  动物中心）175只，体重250～300 g，随机分为3组，A组（假手术组）15只;B组（DHCA模型组）和C组（MP处理组）各80只，每组再分为DHCA后2、6、12 h，1、2、3、7 d共7个小组，每小组10只，其中DHCA后6 h、1 d 两个组为15只。术前6 h 禁食禁水。A组仅暴露双侧颈总动脉，不降温不阻断;B组深低温停循环60min;C组于深低温停循环前30 min腹腔注射MP，剂  量为30 mg ·kg-1。  

　　1.3 大鼠DHCA模型建立 

　　术前30 min肌肉注射阿托品0.02 mg·kg-1，5%水合氯醛6 ml · kg-1腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定于实验台上。温度计插入肛门3 cm，用胶带将其与鼠尾相  固定，监测肛温。颈部正中切口，分别游离两侧颈总动脉及左、右颈外动脉，并双重过线。游离一侧股动脉，动脉置管，取动脉血作血气分析后，用肝素充满连接管后接压力换能器，多功能监护仪监测血压、心电变化及外周血氧饱和度。最后将大鼠放入特制的冰窝，物理降温，每隔5   min记录体温、心率、血压以及血氧饱和度，调整降温速度。当肛温降至21 ℃时，将大鼠取出，取动脉血做血气分析后，经左股动脉进行肝素化（肝素钠300 IU ·kg-1）。随后用24G静脉留置针顺行穿刺左颈外静脉，扎线固定后与三通相连。接着阻断两侧颈总动脉，最后用24G静脉留置针逆行穿刺颈外动脉，扎线固定   留置针，与左侧颈外静脉的静脉留置针相连，开始转流。转流后，将体温维持在（21±1）℃之间，并记录体温、心率、血压以及血氧饱和度。停循环60 min后，拔出颈外动脉处留置针并结扎，回收其管道内血液，经左侧颈外静脉输入，再退出其管内留置针并结扎。最后  松开两侧颈总动脉处动脉夹，恢复颈总动脉血流，检查穿刺处无出血后，逐层缝闭切口。然后将大鼠放入35   ℃早产儿培育箱复温，恢复正常体温4 h后放置室温下正常饲养。  
　　1.4 免疫组化方法

　　检测NMDAR1蛋白表达各组取10只大鼠于DHCA后相应时间点，用含4%多聚甲醛的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液经心脏升主动脉灌流固定，断头置于冰盒玻璃板上取出全脑，放入同样固定液中再固定约24 h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒  操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值，每张切片随机选择4个高倍视野（×400）观察并取其平均值，以灰度值来表示NMDAR1的表达水平，灰度值越高，免疫组化染色越浅，NMDAR1表达越低。  

　　1.5 脑组织超微结构观察 

　　于DHCA再灌注后6 h和1 d，各组取5只大鼠处死，每只大鼠于海马区取1 mm×1 mm×1 mm的小块  组织，于2.5%戊二醛固定后，经0.1 mol·L-1的磷酸  缓冲液冲洗，1%锇酸固定，丙酮脱水，纯树脂浸透包  埋，固化后切片。切片厚度为50～60 nm，醋酸铀与枸缘酸铅染色，透射电镜下观察神经元及神经胶质细胞超微结构的变化。  

　　1.6 统计学处理 
　　
　　所有数据以x-±s 表示，用SPSS 11.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析并以LSD法比较两两差异，P <0.05 为差异有统计学意义。
       
　　2 结  果   

　　2.1 免疫组化表达 

　　见表1。DHCA模型组和MP处理组大鼠脑  NMDAR1蛋白从再灌注2 h起开始升高，于24 h到达高峰（ P <0.01），后逐渐下降，于7 d后基本恢复正常  水平。同时在2、6、12 h，1、2 d 5个时间点，MP组大鼠  脑NMDAR1蛋白表达明显低于DHCA模型组（P<0.01 ）。表1 各组大鼠各时间点脑NMDAR1蛋白表达（略）