不同化学结构肌松药对骨骼肌成人型和胎儿型乙酰胆碱受体的作用
出处：论文网
时间：2006-11-17
【摘要】 目的 应用全细胞膜片钳研究罗库溴铵、维库溴铵或阿曲库铵对成人型和胎儿型肌肉乙酰胆碱受体的作用。方法 通过脂质体转染法在HEK293细胞表达成人型和胎儿型乙酰胆碱受体。分别研究罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵各药对两种受体亚型的作用。结果 罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵呈浓度依赖性抑制乙酰胆碱对成人型和胎儿型乙酰胆碱受体的激动作用。对成人型乙酰胆碱受体抑制程度由大到小依次为维库溴铵>阿曲库铵>罗库溴铵，其对胎儿型乙酰胆碱受体抑制程度由大到小依次为罗库溴铵>维库溴铵>阿曲库铵。结论 不同化学结构肌松药对成人型或胎儿型乙酰胆碱受体的抑制程度不同，而成人型或胎儿型乙酰胆碱受体对一种肌松药的亲和力也有差异。
【关键词】 乙酰胆碱受体；肌松药；相互作用；等效线图分析；HEK293细胞
Effects of rocuronium combined with vecuronium and atracurium on adult-and embryonic- muscular nicotinic acetylcholine receptors
【Abstract】 Objective This study was designed to examine the interaction between rocuronium，vecuronium and atracurium on adult-and embryonic-muscular nicotinic acetylcholine receptors with whole cell clamp patch.Methods The adult-and embryonic-nicotinic acetylcholine receptors were heterologously expressed in HEK293 cells and activated to maximal currents by the application of acetylcholine (100μM).Peak currents were recorded in HEK293 cells treated by rocuronium，vecuronium，atracurium individually using whole cell patch clamp technique.Results All compounds tested alone and in combination produced rapid and readily reversible，concentration-dependent inhibition.The potency of vecuronium is the greatest to adult-nicotinic acetylcholine receptor and the potency of rocuronium is the greatest to embryonic-nicotinic acetylcholien receptor，as rocuronium，vecuronium and atracurium applied individually.Conclusion The effects of different muscle relaxants with dissimilar structure were various to the adult-and the embryonic-nicotinic acetylcholine receptors.
【Key words】 acetylcholine receptor；muscle relaxant；interaction；isobiologram；HEK293 cell
肌松药主要作用于神经肌肉突触后膜的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)，阻断神经冲动的传导，从而使肌肉松弛。突触后膜的乙酰胆碱受体存在两种亚型即存在于健康成人肌细胞突触后膜的成人型乙酰胆碱受体(ε-nAChR) 和存在于胎儿和某些病理情况(如肌肉去神经支配和烧伤等)患者的肌细胞膜的胚胎型乙酰胆碱受体（γ-nAChR）。一些临床研究发现烧伤患者对琥珀胆碱更敏感而对非去极化肌松药不敏感［1～4］。有许多因素影响肌松药的作用，如体内分布容积、蛋白结合率、药物的代谢和消除等因素，在烧伤和去神经支配病人这些因素变化更大。为了更好反映肌松药与nAChR的作用，本研究应用脂质体转染技术在HEK293细胞膜上分别表达骨骼肌突触后膜乙酰胆碱受体的两种亚型(ε-nAChR和γ-nAChR)，从而可以在受体水平研究罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵各药对这两种受体亚型的作用，并在此基础上观察相同化学结构和不相同化学结构的两种肌松药复合对这两种受体亚型的作用。
1 材料与方法
1.1 培养细胞 采用无nAChR表达的HEK293细胞（中科院细胞所提供）作为重组nAChR的靶细胞。在37℃、含5%CO2的培养箱中用DMEM培养基（含10%小牛血清，100u/ml青霉素和100mg/L链霉素及2mM谷氨酰胺）中培养［2］。实验时，用0.25%胰酶消化传代于35mm一次性培养皿（密度为1×105）。培养24h。
1.2 亚克隆目的基因 将含小鼠源性α、β、γ、δ和ε基因的原核细胞表达质粒pSP65α、pSP65β、pSP65δ、pSP64γ和pBSSK(+)ε（ USA SALK美国索克生物研究所提供）通过亚克隆技术连接到真核细胞表达质粒pcDNA3.1上。并用基因测序法鉴定连接是否正确。
1.3 HEK293细胞脂质体转染及功能鉴定 将含有α、β、γ、δ和ε基因的pcDNA3.1质粒，以2：1：1：1的比例与DMRIE-C Reagent（Invitrogen）脂质体混合于1ml无血清培养基，孵育45min后，铺于HEK293细胞上。培养24h后加入含血清的培养基1ml，再培养24h后即可应用。同时，另用不含目的基因的pcDNA3.1质粒转染HEK293细胞作为阴性对照，步骤同上。应用全细胞电压钳观察乙酰胆碱对转染的乙酰胆碱受体的作用。不含目的基因质粒转染的HEK293细胞，乙酰胆碱作用不能激发电流；而含目的基因的质粒转染的HEK293细胞，乙酰胆碱可激发电流。
1.4 膜片钳研究 记录转录后细胞的电流前，先以细胞外液（NaCl，140mM；KCl，5.4mM；CaCl2，1.8mM；MgCl2，1.0；HEPES，10mM；葡萄糖11.1mM；阿托品，1μM；以NaOH调pH至7.4）替换细胞培养基。用PC-10微电极拉制仪（Narishige 公司，日本）分两步将直径1.6～2.0mm玻璃微电极毛胚拉制成微电极，再用MF-830微电极抛光仪抛光。电极内液为（CsCl，150mM；HEPES，10mM；EGTA，5mM；Mg-ATP，2mM；以CsOH调pH至7.3）。电极电阻为3～5mΩ。应用全细胞电压-膜片钳，记录电流。电刺激脉冲的给出及电信号的采入均通过计算机程序pClamp7.0及digidatal1200转换器接口来完成。采样频率1000Hz，低通Bessel滤波0.5kHz。电极阻抗3～5mΩ，封接阻抗大于1gΩ时，吸破细胞膜成全细胞状态。细胞持续以细胞外液（1～2ml/min）灌注。
1.5 给药模式 因HEK293为非兴奋性细胞，从-100mV～-40mV的钳制电压不影响非去极化肌松药的效应［２］。实验膜钳制电压均设为-80mV。
（1）乙酰胆碱对ε-nAChR和γ-nAChR的作用：分别以不同浓度（10nM～1mM）乙酰胆碱（Ach）刺激转染后的HEK293细胞。结果见前期研究。根据结果显示100μM Ach可激动约93%的受体，属于饱和浓度，因此以下实验均采用100μM Ach作为激动药的浓度。
（2）罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵各药单独对ε-nAChR和γ-nAChR的作用：预先用不同浓度罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵平衡HEK293细胞30s，再给予100μM Ach激动受体。给不同浓度肌松药前、后做单用乙酰胆碱的对照。持续给乙酰胆碱4～5s，记录峰电流。两次用药刺激间隔2～3min，用细胞外液持续冲洗，以减少细胞脱敏感。
1.6 数据分析 按改良Hill公式计算得罗库溴铵和维库溴铵各自的浓度效应曲线。采用clampfit 8.0进行图形处理和用origin 5.0进行数据分析。得出两药的IC50值。数据用均数±标准差表示。统计以组间单因素方差分析和配对资料t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵可抑制Ach刺激转染后的HEK293细胞的ε-nAChR或γ-nAChR的内向电流，并呈浓度依赖性，见表1和图1（A，B，C，D）。
【关键词】 乙酰胆碱受体；肌松药；相互作用；等效线图分析；HEK293细胞
Effects of rocuronium combined with vecuronium and atracurium on adult-and embryonic- muscular nicotinic acetylcholine receptors
【Abstract】 Objective This study was designed to examine the interaction between rocuronium，vecuronium and atracurium on adult-and embryonic-muscular nicotinic acetylcholine receptors with whole cell clamp patch.Methods The adult-and embryonic-nicotinic acetylcholine receptors were heterologously expressed in HEK293 cells and activated to maximal currents by the application of acetylcholine (100μM).Peak currents were recorded in HEK293 cells treated by rocuronium，vecuronium，atracurium individually using whole cell patch clamp technique.Results All compounds tested alone and in combination produced rapid and readily reversible，concentration-dependent inhibition.The potency of vecuronium is the greatest to adult-nicotinic acetylcholine receptor and the potency of rocuronium is the greatest to embryonic-nicotinic acetylcholien receptor，as rocuronium，vecuronium and atracurium applied individually.Conclusion The effects of different muscle relaxants with dissimilar structure were various to the adult-and the embryonic-nicotinic acetylcholine receptors.
【Key words】 acetylcholine receptor；muscle relaxant；interaction；isobiologram；HEK293 cell
肌松药主要作用于神经肌肉突触后膜的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)，阻断神经冲动的传导，从而使肌肉松弛。突触后膜的乙酰胆碱受体存在两种亚型即存在于健康成人肌细胞突触后膜的成人型乙酰胆碱受体(ε-nAChR) 和存在于胎儿和某些病理情况(如肌肉去神经支配和烧伤等)患者的肌细胞膜的胚胎型乙酰胆碱受体（γ-nAChR）。一些临床研究发现烧伤患者对琥珀胆碱更敏感而对非去极化肌松药不敏感［1～4］。有许多因素影响肌松药的作用，如体内分布容积、蛋白结合率、药物的代谢和消除等因素，在烧伤和去神经支配病人这些因素变化更大。为了更好反映肌松药与nAChR的作用，本研究应用脂质体转染技术在HEK293细胞膜上分别表达骨骼肌突触后膜乙酰胆碱受体的两种亚型(ε-nAChR和γ-nAChR)，从而可以在受体水平研究罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵各药对这两种受体亚型的作用，并在此基础上观察相同化学结构和不相同化学结构的两种肌松药复合对这两种受体亚型的作用。
1 材料与方法
1.1 培养细胞 采用无nAChR表达的HEK293细胞（中科院细胞所提供）作为重组nAChR的靶细胞。在37℃、含5%CO2的培养箱中用DMEM培养基（含10%小牛血清，100u/ml青霉素和100mg/L链霉素及2mM谷氨酰胺）中培养［2］。实验时，用0.25%胰酶消化传代于35mm一次性培养皿（密度为1×105）。培养24h。
1.2 亚克隆目的基因 将含小鼠源性α、β、γ、δ和ε基因的原核细胞表达质粒pSP65α、pSP65β、pSP65δ、pSP64γ和pBSSK(+)ε（ USA SALK美国索克生物研究所提供）通过亚克隆技术连接到真核细胞表达质粒pcDNA3.1上。并用基因测序法鉴定连接是否正确。
1.3 HEK293细胞脂质体转染及功能鉴定 将含有α、β、γ、δ和ε基因的pcDNA3.1质粒，以2：1：1：1的比例与DMRIE-C Reagent（Invitrogen）脂质体混合于1ml无血清培养基，孵育45min后，铺于HEK293细胞上。培养24h后加入含血清的培养基1ml，再培养24h后即可应用。同时，另用不含目的基因的pcDNA3.1质粒转染HEK293细胞作为阴性对照，步骤同上。应用全细胞电压钳观察乙酰胆碱对转染的乙酰胆碱受体的作用。不含目的基因质粒转染的HEK293细胞，乙酰胆碱作用不能激发电流；而含目的基因的质粒转染的HEK293细胞，乙酰胆碱可激发电流。
1.4 膜片钳研究 记录转录后细胞的电流前，先以细胞外液（NaCl，140mM；KCl，5.4mM；CaCl2，1.8mM；MgCl2，1.0；HEPES，10mM；葡萄糖11.1mM；阿托品，1μM；以NaOH调pH至7.4）替换细胞培养基。用PC-10微电极拉制仪（Narishige 公司，日本）分两步将直径1.6～2.0mm玻璃微电极毛胚拉制成微电极，再用MF-830微电极抛光仪抛光。电极内液为（CsCl，150mM；HEPES，10mM；EGTA，5mM；Mg-ATP，2mM；以CsOH调pH至7.3）。电极电阻为3～5mΩ。应用全细胞电压-膜片钳，记录电流。电刺激脉冲的给出及电信号的采入均通过计算机程序pClamp7.0及digidatal1200转换器接口来完成。采样频率1000Hz，低通Bessel滤波0.5kHz。电极阻抗3～5mΩ，封接阻抗大于1gΩ时，吸破细胞膜成全细胞状态。细胞持续以细胞外液（1～2ml/min）灌注。
1.5 给药模式 因HEK293为非兴奋性细胞，从-100mV～-40mV的钳制电压不影响非去极化肌松药的效应［２］。实验膜钳制电压均设为-80mV。
（1）乙酰胆碱对ε-nAChR和γ-nAChR的作用：分别以不同浓度（10nM～1mM）乙酰胆碱（Ach）刺激转染后的HEK293细胞。结果见前期研究。根据结果显示100μM Ach可激动约93%的受体，属于饱和浓度，因此以下实验均采用100μM Ach作为激动药的浓度。
（2）罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵各药单独对ε-nAChR和γ-nAChR的作用：预先用不同浓度罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵平衡HEK293细胞30s，再给予100μM Ach激动受体。给不同浓度肌松药前、后做单用乙酰胆碱的对照。持续给乙酰胆碱4～5s，记录峰电流。两次用药刺激间隔2～3min，用细胞外液持续冲洗，以减少细胞脱敏感。
1.6 数据分析 按改良Hill公式计算得罗库溴铵和维库溴铵各自的浓度效应曲线。采用clampfit 8.0进行图形处理和用origin 5.0进行数据分析。得出两药的IC50值。数据用均数±标准差表示。统计以组间单因素方差分析和配对资料t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵可抑制Ach刺激转染后的HEK293细胞的ε-nAChR或γ-nAChR的内向电流，并呈浓度依赖性，见表1和图1（A，B，C，D）。
表1 罗库溴铵、维库溴铵和阿曲库铵对ε-nAChR和γ-nAChR作用的IC50值 （μM，mean±SD，n = 5）
注：NMB=神经肌肉阻滞药；ε-nAChR组和γ-nAChR组相比较，*P＜0.05；ε-nAChR组和γ-nAChR组组内比较，#P＜0.05；ε-nAChR组和γ-nAChR组相比较，**P＜0.01；ε-nAChR组和γ-nAChR组组内比较，##P＜0.01
罗库溴铵对ε-nAChR50%抑制浓度（IC50）明显大于对γ-nAChR作用的IC50，P＜0.001；维库溴铵抑制ε-nAChR的IC50值显著小于对γ-nAChR的IC50值，P＜0.05；阿曲库铵抑制ε-nAChR的IC50值显著小于对γ-nAChR的IC50值，P＜0.05。
