人源抗狂犬病毒特免血浆筛查方法的建立
【关键词】 抗狂犬病毒抗体；狂犬病疫苗；ELISA；检测；中和试验
Establishment of method to screening human anti-rabies virus positive plasma
【Abstract】 Objective The positive human plasma containing antibody against rabies virus was screened with ELISA kit.Methods The IgG antibody diagnostic kits(ELISA method) obtaining from several manufactures in our country were adopted to screen the anti rabies virus positive plasma combining with the mice neutralization test. The level of antibody against rabies virus was determined in blood samples of donors that were immunized with rabies vaccine on days0,3,7,14and 28 in schedule.Results It showed that test results of ELISA kit produced in manufacture C and D is similar, their linear correlation is better(rc=0.997,ra=0.996 respectively).Conclusion The mice neutralization test can be replaced by ELISA kit methods.
【Key words】 antibody against rabies virus；rabies vaccine； ELISA； neutralization test；screening
狂犬病是一种严重危害人类生命的人畜共患疾病，主要通过带狂犬病毒的动物传播给人类，发病后致死率为100％。据卫生部2005年10月公布的数字表明，病死率仍居我国法定传染病的第2位，据调查，近年来狂犬病发病呈上升趋势，目前尚无治疗狂犬病的有效药物。虽然狂犬病抗血清对预防狂犬病起着重要作用，但其来源因系异源性蛋白而副反应较大，使用中易发生变态反应和血清病，其发生率为15％～45％［1］，而且对某些疫苗的抗体反应有抑制作用［2］，使用人源狂犬病免疫球蛋白（HRIG）则克服了上述缺点，与异源抗体相比，具有在血液中维持时间较长、保护效果好的优点，这使得HRIG的需求量越来越大［3］，为此，我们于2003年末开始进行人源抗狂犬病抗体血浆的筛查工作，目的是早日开发出安全有效的HRIG制品。但由于方法学的限制，《中华人民共和国药典2005年版三部（附录ⅪJ）》规定的小鼠效力中和试验（NIH）［4］方法难于做大规模的检测。为寻找适合的方法，笔者曾建立了间接ELISA法测定狂犬病毒抗体的方法，并进一步证实了该方法与小鼠中和法有良好的相关性，但现有ELISA法在实际应用中有灵敏度不高、且存在漏检的问题。为解决上述问题，笔者结合小鼠中和法对国内4个ELISA厂家的狂犬病毒抗体ELISA诊断试剂盒进行筛选和比较，获得了较满意的结果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 狂犬病毒抗原
狂犬病毒北京固定毒AG株适应地鼠肾细胞传代培养的病毒悬液经灭活初步纯化后的疫苗原液，由兰州生物制品研究所疫苗四室提供。
1.1.2 ELISA检测试剂
ELISA定量检测人抗狂犬病抗体诊断试剂（批号分别为：20040703、20050301、20050302、20050801）分别由兰州生物制品研究所、宁波天润生物药业有限公司、武汉生物制品研究所、珠海海泰生物制药有限公司提供），抗狂犬病参考血清由中国药品生物制品检定所惠赠。
1.1.3 人用狂犬病疫苗和工作对照品
人用浓缩狂犬病疫苗（≥2.5 IU/瓶），批号20040401、20040403、20041101。工作对照品（HRIG）批号9008。以上制品均由兰州生物制品研究所生产。
1.1.4 实验样本
狂犬病毒抗体阳性血浆20份（SNT效价≥10 IU/ml），阴性血浆100份，均由兰州生物制品研究所血液制剂室提供。
1.2 方法
首先对供浆者进行0、3、7、14、28日程序狂犬疫苗注射，于最后一针1个月后采集血样，用ELISA试剂盒检测其相对效价，将此血样与标准品进行系列稀释，分别与狂犬病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定的时间内，观察小鼠存活和死亡情况，测定出供试品效价，之后再用小鼠中和法试验SNT效价进行比较。将中和法测得SNT效价结果≥10 IU/ml的样品，再用其他三家ELISA［4］试剂盒进行检测。最终筛选出与小鼠中和法试验结果相接近的试剂盒作为大规模筛查狂犬病抗体阳性血浆初筛试剂盒，设计出能满足单采浆站特异性免疫血浆筛选的需要和可靠的收浆方案。
2 结果
2.1 初免后两种检测方法的比较
按0、3、7、14、28日程序免疫后1个月采集的血样用两种方法检测的结果比较，见表1。表1 初免后两种检测方法的比较 （略） 注：兰生所试剂（批号为20040703）
从表1可以看出，小鼠中和法与A厂家ELISA试剂盒检测结果存在很大差异，从而导致了大量的特免血浆漏检。
