益气活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因表达的影响
表1 益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因mRNA表达的影响（目的基因/βactin）（略）
Tab 1 Effects of qibenefiting and bloodactivating recipes on mRNA expressions of p16, p21, PCNA, cyclin D1 and
cyclin E genes in the liver of rats (target gene/βactin)
*P<0.05,**P<0.01, vs young control group; △△P<0.01, vs untreated group
表2 益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因蛋白表达的影响（目的基因/βactin）（略）
Tab 2 Effects of qibenefiting and bloodactivating recipes on protein expressions of p16，p21，PCNA，cyclin D1 and
cyclin E genes in the liver of rats (target gene/βactin)
**P<0.01, vs young control group; △△P<0.01, vs untreated group
图3 p16、p21、PCNA、cyclin D1和cyclin E蛋白印迹杂交结果（略）
Fig 3 Western blotting results of p16, p21, PCNA, cyclin D1 and cyclin E genes
1:Young control group; 2: Untreated group; 3: Qibenefiting recipetreated group; 4: Bloodactivating recipetreated group
3讨论
衰老是生物体在其生命的后期阶段所出现的进行性、全身性、内在性，由多因素共同作用的循序渐进的退化过程。近年来从基因水平研究衰老过程已成为衰老机制研究中的热点。已经发现：有些细胞增殖调控相关基因，主要是原癌基因、抑癌基因及端粒酶调控相关基因等，在年轻和衰老细胞中的表达明显不同。原癌基因是一组参与细胞增殖和生长调控的基因。细胞衰老时，多数原癌基因的表达水平降低，少数升高。由于原癌基因表达产物大多是信号传导途径或细胞周期蛋白相关成员，它们的表达水平降低或活性减弱，会使细胞对刺激的反应性降低，或使细胞周期进程减慢，从而降低细胞增殖水平。抑癌基因的主要功能是对细胞分裂和生长进行适当抑制，防止细胞周期失控导致无限扩增和分裂生长。衰老时，有些抑癌基因的表达或活性增加。具有细胞增殖调控功能的衰老相关基因包括p21、p16、细胞周期素（cyclin）D1、周期素依赖性激酶(cyclindependent kinases, CDK) 2、p53、视网膜母细胞瘤（retinablastoma, Rb）基因和PCNA等。上述衰老相关基因的调控是相互联系的［9］。
中医认为人体的生长、发育和衰老与“肾”密切相关。“肾精虚衰”是衰老的主要原因。同时又认为“脾胃为血气阴阳之根蒂”，“脾胃既和，其人寿；脾胃不和，其人夭”，因此也重视奉养脾胃精气在延年中的作用。《素问・至真要大论》还提出“气血正平，长有天命”，气血运行失常，则能影响脏腑、经络、阴阳等方面功能的平衡，出现五脏六腑各方面病变，加速衰老过程。因此纵观历代文献有关“耐老”、“不老”方药，研究其治法基本属于补肾、健脾、益气、活血范畴。
本实验主要在比较补肾、健脾、益气、活血方药对衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞2BS细胞增殖调控作用的基础上，进一步观察益气、活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因p16、p21、cyclin D1、PCNA和cyclin E的mRNA转录和蛋白表达的影响，以探讨益气、活血方药对老年大鼠肝脏细胞增殖的作用机制。结果表明：老年大鼠肝脏p16、p21、cyclin D1基因mRNA和蛋白表达明显升高；PCNA、cyclin E mRNA和蛋白表达明显降低。提示：老年大鼠肝脏细胞周期蛋白依赖的激酶抑制因子p21、p16表达增高，可能通过抑制cyclin D1CDK4和cyclin ECDK2的活性，使Rb蛋白磷酸化水平降低，从而抑制细胞增殖。p21还可能与PCNA结合，使DNA合成受阻。由于细胞不能进入增殖周期，最终发生衰老。细胞周期蛋白cyclin D1是原癌基因的表达物，与CDK4结合后，可促进G1/S期转变。文献报道：衰老时cyclin D1蛋白水平升高，但cyclin D1CDK4复合物活性降低，影响细胞增殖［10］。本实验结果显示：衰老大鼠肝脏cyclin D1的升高与文献报道一致。PCNA为DNA聚合酶δ的附属蛋白，参与DNA复制；cyclin E与CDK2结合，参与G1/S期的转变。本实验结果显示：与青年鼠比较，老年大鼠PCNA和cyclin E的表达明显下调，则必然影响细胞周期的正常运行，抑制细胞增殖。益气、活血方药能不同程度降低老年大鼠肝脏cyclin D1基因mRNA和蛋白的表达，上调肝脏cyclin E基因mRNA和蛋白的表达，但对p16、p21、PCNA mRNA和蛋白的表达作用不明显。结合本实验室前期实验流式细胞仪检测细胞周期的结果（益气、活血方药可降低老年大鼠肝组织细胞G0/G1期比例，增加G2/G1期细胞比值），提示益气、活血方药可促进老年大鼠肝组织细胞的增殖［11］。益气、活血方药还能不同程度提高2BS衰老细胞的代谢活力和降低衰老相关半乳糖苷酶的活力［12,13］，推测益气、活血方药促进老年大鼠肝组织细胞增殖的作用可能部分与下调cyclin D1、上调cyclin E mRNA和蛋白的表达有关。
［参考文献］
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13陈方敏, 赵伟康, 徐品初, 等. 补肾、益气、健脾、活血法对衰老细胞周期基因表达的调控作用［J］. 中国中西医结合杂志, 2003, 23(11): 837840.
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