益气活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因表达的影响

【关键词】  肝细胞

    ［摘要］目的：观察益气、活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因表达的影响。方法：以自然衰老大鼠为衰老模型，采用RTPCR、Western blotting法研究益气、活血方药对老年大鼠肝脏p16、p21、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、cyclin D1和cyclin E mRNA转录和蛋白表达的影响。结果：老年大鼠肝脏p16、p21、cyclin D1 mRNA转录和蛋白的表达增加；PCNA、cyclin E mRNA转录和蛋白的表达降低。与老年大鼠比较，益气、活血方药可下调老年大鼠肝脏cyclin D1 mRNA转录和蛋白表达，上调促进增殖基因cyclin E mRNA转录和蛋白表达，但对p16、p21和PCNA的调节作用不明显。结论：益气、活血方药主要通过调控cyclin D1和cyclin E mRNA转录和蛋白表达而促进细胞增殖。

　　［关键词］衰老大鼠; 肝细胞; p16; p21; 增殖细胞核抗原; cyclin D1; cyclin E; 益气方; 活血方

　　Effects of recipes for replenishing qi and activating blood on senescence related gene expressions in the liver of aging rats

　　ABSTRACT  Objective: To observe the effects of recipes for replenishing qi and activating blood on p16, p21, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), cyclin D1 and cyclin E gene expressions in the liver of aging rats. Methods: A recipe for replenishing qi and a recipe for activating blood were administered to aging rats respectively, and the effects of the above recipes on the expressions of senescence related genes (p16, p21, PCNA, cyclin D1 and cyclin E) were examined by RTPCR and Western blotting methods. Results: The expressions of p16, p21 and cyclin D1 mRNAs and proteins in the liver of the untreated aging rats were upregulated, while the expressions of PCNA and cyclin E mRNAs and proteins decreased. As compared with the untreated aging rats, both recipes could downregulate the expressions of cyclin D1 mRNA and protein and upregulate the expressions of cyclin E mRNA and protein, but had no obvious effects on the expressions of mRNAs and proteins of p16, p21 and PCNA. Conclusion: Recipes for replenishing qi and activating blood can improve the liver cell proliferation of aging rats via downregulating the expressions of cyclin D1 mRNA and protein and upregulating the expressions of cyclin E mRNA and protein.

　　KEY WORDS  aging rats; hepatocytes; p16; p21; proliferating cell nuclear antigen; cyclin D1; cyclin E; qibenefiting recipe; bloodactivating recipe

　　随着细胞及分子生物学的发展，已经发现一些与细胞衰老密切相关的基因及转录因子（反式作用因子）［1～3］。纵观历代中医文献，延缓衰老的方药基本属于补肾、健脾、益气和活血范畴。近代研究显示：上述四类方药均有不同程度抗自由基、调节免疫功能、提高肝脏蛋白质含量、改善肝脏超微结构等延缓衰老的作用［4］。实验研究还表明：补肾方药能促进老年大鼠肝脏cHras、cmyc、cfos、cjun mRNA的表达，下调p53 mRNA的表达［5］。本实验从细胞增殖调控角度，根据中医理论，从益气活血的抗衰经典方中分别选择几味有代表性的中药组成小复方，以自然衰老大鼠为衰老模型，应用RTPCR和Western blotting法研究益气、活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因p16、p21、cyclin D1、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和cyclin E表达的影响。

　　1材料与方法

　　1.1实验中药  益气方选用党参、黄芪、炙甘草（取自《时氏医道》保元汤），活血方选用川芎、当归、赤芍（取自经方四物汤）。中药制剂采用水提醇沉法制备后，分装于消毒好的塑料瓶中，于－20 ℃保存。

　　1.2实验动物  SD雄性大鼠（上海中医药大学实验动物中心提供）24只，分成青年对照组（5月龄）、老年对照组（22月龄）、老年益气组（22月龄）和老年活血组（22月龄）。老年益气组和活血组的用药剂量为临床成人剂量的20倍（按每千克体质量的用药量进行换算），采用饮料方式给药，每周服药5 d，停药2 d，自18～22月龄连续给药4个月。

　　1.3RTPCR  肝组织细胞总的RNA按Trizol一步法提取，具体步骤按试剂说明书操作。βactin PCR引物［6］：5’CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG 3’，5’GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA 3’，扩增片段为378 bp；p16 PCR引物：5’ATGGAGTCCTCTGCAGATAG 3’，5’TTAG CGCTGCTTTGGGGGTT 3’，扩增片段为480 bp；p21PCR引物：5’ATGTCCGATCCTGGTGATGT3’，5’GGGCTTTCTCTTGCAGAAGA 3’，扩增片段为495 bp；cyclin D1 PCR引物：5’ATGGAACACCAGCTCCTGTG 3’，5’TGGTGTTCCATGTCGGTGG 3’，扩增片段为888 bp；PCNA PCR引物：5’ATGTTTGAGGCACGCCTGAT3’，5’AGATCCTTCTTCATCTTCGA 3’，扩增片段为786 bp；cyclin E PCR引物：5’AAAGAAGAAGGTGGTTCCGA 3’，5’TCATTCTGTCTCCT GCTCAC 3’，扩增片段为1 191 bp。PCR扩增反应总体积为50 μl。扩增程序为：95 ℃（30 s）→ ［变性94 ℃（30 s）→退火55 ℃(30 s)→延伸72 ℃ (30 s)］×30个循环→72 ℃ （7 min）→4 ℃贮存。根据目的片段的长短及引物的Tm值设置退火温度及延伸时间。PCR产物鉴定电泳，紫外灯下观察，图像分析系统扫描。

　　1.4Western Blotting  采用放射免疫沉淀测定法(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)［7］。取肝脏组织100 mg加入单去污细胞裂解液900 μl，冰浴中匀浆。匀浆后立即加入100 μl蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟液(phenylmethylsulphonyl fluoride, PMSF)和40 μl混合蛋白酶抑制complete液(complete EDTAfree protease inhibitor cocktail tablet, 1片加1 ml水），4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，取上清液于－70 ℃冷冻保存。24 h后10 000 r/min离心10 min，取上清液分装，－70 ℃冷冻保存。Lowry (FolinCiocalteau)法［8］测定蛋白含量。各组蛋白各取30 μg，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)和免疫印迹反应，用Supersignal ECL发光剂荧光显色X光胶片曝光，观察蛋白条带。

　　1.5图像处理及统计分析  RTPCR、Westernblotting实验结果分别采用Leica Q500IW和上海复日Smartview 2001生物电泳图像分析系统进行图像分析。所有实验数据均采用SPSS 9.0统计软件进行统计处理，统计学方法采用方差分析及q检验。

　　2结果

　　2.1益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因mRNA表达的影响与青年组比较，老年大鼠肝脏p16、p21、cyclin D1基因mRNA的表达明显上调（P<0.01），PCNA和cyclin E mRNA的表达明显下调（P<0.01）。与老年组比较，益气、活血方药组cyclin D1基因mRNA的表达明显下调（P<0.01），而cyclin E mRNA的表达则明显上调。益气、活血方药对p16、p21和PCNA mRNA的表达有改善作用，但无统计学意义。见图1、图2、表1。

　　2.2益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因蛋白表达的影响与青年组比较，老年大鼠肝脏p16、p21、cyclin D1基因蛋白表达明显上调（P<0.01），PCNA和cyclin E蛋白表达明显下调（P<0.01）。与老年组比较，益气、活血方药组cyclin D1基因蛋白表达明显下调（P<0.01），而cyclin E蛋白表达明显升高（P<0.01）。见表2、图3。

　　图1  p16和p21琼脂糖凝胶电泳（略）

　　Fig 1  Agarose gel electrophoresis of p16 and p21

　　M: Marker; 1:Young control group; 2: Untreated group; 3: Qibenefiting recipetreated group; 4: Bloodactivating recipe treated group

　　图2  cyclin D1、PCNA和cyclin E琼脂糖凝胶电泳（略）

　　Fig 2  Agarose gel electrophoresis of  cyclin D1, PCNA and cyclin E

　　M: Marker; 1: Young control group; 2: Untreated group; 3: Qibenefiting recipetreated group; 4: Bloodactivating recipetreated group