乙醇对小鼠原代肝细胞脂肪酸氧化速度的影响
出处：论文网
时间：2007-05-08
【摘要】 目的 建立小鼠肝细胞的体外培养方法，同时检测乙醇对肝细胞脂肪酸β-氧化速度的影响。方法 采用戊巴比妥麻醉小鼠，通过肝脏灌注和胶原酶消化分离小鼠肝细胞，接种于胶原包被的培养皿中进行体外培养。通过HE染色观察细胞的生长状态。在20mmol/L乙醇存在的情况下，通过3H标记的棕榈酸（C16:0）检测肝细胞的脂肪酸氧化速度。结果 成功地分离了肝细胞，肝细胞的存活率≥95%。肝细胞在体外培养48h仍能够保持良好的生长状态。对肝细胞脂肪酸氧化速度的研究发现，20mmol/L酒精能够导致肝细胞的脂肪酸氧化速度降低40%左右，导致肝细胞中脂肪含量增加。结论 本研究成功地建立肝细胞的体外培养方法，采用3H标记的脂肪酸能够敏感地检测脂肪酸氧化速度，而研究发现乙醇能够抑制肝细胞脂肪酸氧化速度。同时，本研究结果为肝细胞的脂肪和糖类代谢的研究提供了实验条件。
【关键词】 乙醇；肝细胞；脂肪酸
The effect of ethanol on fatty acid oxidation of mice primary hepatocytes
【Abstract】 Objective To isolate the mice primary hepatocytes，and the cells were cultured in vitro.The influence of ethanol on fatty acid β-oxidation velocity was measured.Methods The mouse was anesthetized with pentobarbital，and the liver was degested with collagenase.The primary hepatocytes were inoculated in collagen-coated dishes.The morphology of cultured primary hepatocytes was observed by HE staining.The fatty acid β-oxidation was measured using ［9，10-3H］ palmitic acid (C16:0) as a tracer.Results The primary hepatocytes were isolated and cultured successfully，and the viability was more than 95%.20mmol/L ethanol could reduce the speed of fatty acid β-oxidation about 40%，and lead to the increased lipid level in hepatocytes.Conclusion We isolated and cultured the mouse primary hepatocytes in vitro，and the influence of ethanol on fatty acid β-oxidation was determined.This study is helpful for the research on the lipid metabolism in liver.
【Key words】 ethanol;hepatocyte;fatty acid
肝脏在脂肪、糖和蛋白质的代谢过程中具有重要的作用。在体内肝细胞的代谢受到各种因素的影响。酒精在人肝细胞中主要由乙醇脱氢酶和过氧化氢酶代谢成具有细胞毒性的乙醛，然后由乙醛脱氢酶代谢为乙酸。在这个过程中，肝脏的糖脂代谢将受到影响。本研究通过体外分离肝细胞和培养，研究乙醇对肝细胞的脂肪酸氧化速度的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 C57BL/6小鼠由第四军医大学实验动物中心提供；戊巴比妥钠、胶原酶、胰岛素、异丙肾上腺素，棕榈酸为Sigma公司；［9，10-3H］Palmitic acid为Amersham Bioscience产品；Hisafe 3闪烁计数液为PE公司产品。
1.2 肝细胞的分离 取C57BL/6小鼠，采用戊巴比妥钠（100mg/kg）麻醉；打开小鼠腹腔，向左侧移开小肠，暴露下腔静脉和门静脉，使用3号丝线从肾静脉近端绕过下腔静脉；采用21号套管针从下腔静脉传入，直至接近肝静脉；用丝线固定套管针，采用含有1mM EGTA和0.1%葡萄糖的Kreb-Ringer缓冲液灌注肝脏，同时迅速切断门静脉使灌注液从门静脉流出，灌注压力为20cm水柱，灌注速度为4ml/min；灌注20ml后更换含有0.5mg/ml胶原酶和5mM CaCl2的灌注液继续灌注10min，立刻小心取出肝脏，置于含有Kreb-Ringer缓冲液的10mM培养皿中，用剪刀剪开肝脏包膜，轻轻晃动使肝细胞释放出来；采用70μm的细胞滤器过滤；使用10%FBS的DMEM洗涤细胞2次，50×g离心。
1.3 存活性鉴定 分离后的肝细胞立刻用4%台盼蓝染色，在显微镜下观察，核呈蓝色为死细胞，拒染的细胞为活细胞，将细胞接种于胶原包被的12孔培养皿中，采用含有10%胎牛血清，100u/ml青霉素和链霉素的DMEM培养液，在5%CO2，37°C培养。
1.4 形态学观察 （1）脂肪染色：取不同培养时间的肝细胞，4%多聚醛溶液固定，油红O（Oil Red O）染色，再用苏木精衬染细胞核，缓冲甘油封片后，观察肝细胞中脂肪的含量。（2）苏木精-伊红（HE）染色：固定的肝细胞用苏木精-伊红染色，脱水透明后，观察不同生长时间的细胞形态变化。
1.5 脂肪酸氧化速度 肝细胞脂肪酸氧化速度根据文献进行［1］，将分离的肝细胞接种到12孔细胞培养板中，2 ×105/孔，细胞贴壁12h后开始测定肝细胞脂肪酸的氧化速度。先用PBS洗涤细胞2次，每孔加入500μl含有0.5mg/ml BSA，22μM ［9，10(n)-3H］棕榈酸 (1μCi/孔)的Hanks液，试验孔中同时加入20mM乙醇，每组3个复孔。37°C培养2h后将培养液立即转移到玻璃试管中，并采用0.5ml Hanks液洗涤细胞2次，将洗涤液也加入玻璃试管中。采用Folch法抽提脂肪酸，每管中加入8ml 甲醇/氯仿(2:1)和0.5ml 2 M KCl/2 M HCl溶液。剧烈混合30min后离心，将上层水相转移到一个新的玻璃试管中，继续采用甲醇/氯仿抽提一次，将水相转移到闪烁瓶中，加入10ml闪烁液，混合后采用闪烁计数器测定脂肪酸氧化后生成的3H2O量。肝细胞的蛋白含量采用Brad-ford法进行测定。
2 结果
2.1 分离肝细胞存活率 肝细胞分离的存活率，大于95%。
2.2 形态学观察结果 分离的肝细胞，在培养12h后即能够充分贴壁生长。肝细胞在生长的早期（24～48h）细胞状态较好，可见明显细胞极性，细胞排列生长（图1A）。细胞生长后期（>4天），肝细胞生长出现排列紊乱，细胞突触增多（图1B），并可见细胞分裂像（图1C）。
【关键词】 乙醇；肝细胞；脂肪酸
The effect of ethanol on fatty acid oxidation of mice primary hepatocytes
【Abstract】 Objective To isolate the mice primary hepatocytes，and the cells were cultured in vitro.The influence of ethanol on fatty acid β-oxidation velocity was measured.Methods The mouse was anesthetized with pentobarbital，and the liver was degested with collagenase.The primary hepatocytes were inoculated in collagen-coated dishes.The morphology of cultured primary hepatocytes was observed by HE staining.The fatty acid β-oxidation was measured using ［9，10-3H］ palmitic acid (C16:0) as a tracer.Results The primary hepatocytes were isolated and cultured successfully，and the viability was more than 95%.20mmol/L ethanol could reduce the speed of fatty acid β-oxidation about 40%，and lead to the increased lipid level in hepatocytes.Conclusion We isolated and cultured the mouse primary hepatocytes in vitro，and the influence of ethanol on fatty acid β-oxidation was determined.This study is helpful for the research on the lipid metabolism in liver.
【Key words】 ethanol;hepatocyte;fatty acid
肝脏在脂肪、糖和蛋白质的代谢过程中具有重要的作用。在体内肝细胞的代谢受到各种因素的影响。酒精在人肝细胞中主要由乙醇脱氢酶和过氧化氢酶代谢成具有细胞毒性的乙醛，然后由乙醛脱氢酶代谢为乙酸。在这个过程中，肝脏的糖脂代谢将受到影响。本研究通过体外分离肝细胞和培养，研究乙醇对肝细胞的脂肪酸氧化速度的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 C57BL/6小鼠由第四军医大学实验动物中心提供；戊巴比妥钠、胶原酶、胰岛素、异丙肾上腺素，棕榈酸为Sigma公司；［9，10-3H］Palmitic acid为Amersham Bioscience产品；Hisafe 3闪烁计数液为PE公司产品。
1.2 肝细胞的分离 取C57BL/6小鼠，采用戊巴比妥钠（100mg/kg）麻醉；打开小鼠腹腔，向左侧移开小肠，暴露下腔静脉和门静脉，使用3号丝线从肾静脉近端绕过下腔静脉；采用21号套管针从下腔静脉传入，直至接近肝静脉；用丝线固定套管针，采用含有1mM EGTA和0.1%葡萄糖的Kreb-Ringer缓冲液灌注肝脏，同时迅速切断门静脉使灌注液从门静脉流出，灌注压力为20cm水柱，灌注速度为4ml/min；灌注20ml后更换含有0.5mg/ml胶原酶和5mM CaCl2的灌注液继续灌注10min，立刻小心取出肝脏，置于含有Kreb-Ringer缓冲液的10mM培养皿中，用剪刀剪开肝脏包膜，轻轻晃动使肝细胞释放出来；采用70μm的细胞滤器过滤；使用10%FBS的DMEM洗涤细胞2次，50×g离心。
1.3 存活性鉴定 分离后的肝细胞立刻用4%台盼蓝染色，在显微镜下观察，核呈蓝色为死细胞，拒染的细胞为活细胞，将细胞接种于胶原包被的12孔培养皿中，采用含有10%胎牛血清，100u/ml青霉素和链霉素的DMEM培养液，在5%CO2，37°C培养。
1.4 形态学观察 （1）脂肪染色：取不同培养时间的肝细胞，4%多聚醛溶液固定，油红O（Oil Red O）染色，再用苏木精衬染细胞核，缓冲甘油封片后，观察肝细胞中脂肪的含量。（2）苏木精-伊红（HE）染色：固定的肝细胞用苏木精-伊红染色，脱水透明后，观察不同生长时间的细胞形态变化。
1.5 脂肪酸氧化速度 肝细胞脂肪酸氧化速度根据文献进行［1］，将分离的肝细胞接种到12孔细胞培养板中，2 ×105/孔，细胞贴壁12h后开始测定肝细胞脂肪酸的氧化速度。先用PBS洗涤细胞2次，每孔加入500μl含有0.5mg/ml BSA，22μM ［9，10(n)-3H］棕榈酸 (1μCi/孔)的Hanks液，试验孔中同时加入20mM乙醇，每组3个复孔。37°C培养2h后将培养液立即转移到玻璃试管中，并采用0.5ml Hanks液洗涤细胞2次，将洗涤液也加入玻璃试管中。采用Folch法抽提脂肪酸，每管中加入8ml 甲醇/氯仿(2:1)和0.5ml 2 M KCl/2 M HCl溶液。剧烈混合30min后离心，将上层水相转移到一个新的玻璃试管中，继续采用甲醇/氯仿抽提一次，将水相转移到闪烁瓶中，加入10ml闪烁液，混合后采用闪烁计数器测定脂肪酸氧化后生成的3H2O量。肝细胞的蛋白含量采用Brad-ford法进行测定。
2 结果
2.1 分离肝细胞存活率 肝细胞分离的存活率，大于95%。
2.2 形态学观察结果 分离的肝细胞，在培养12h后即能够充分贴壁生长。肝细胞在生长的早期（24～48h）细胞状态较好，可见明显细胞极性，细胞排列生长（图1A）。细胞生长后期（>4天），肝细胞生长出现排列紊乱，细胞突触增多（图1B），并可见细胞分裂像（图1C）。
图1 体外培养的肝细胞形态
Fig 1 the morphology of cultured primary hepatocytes
A: Cultured 24 hr; B: Cultured 96 hr; C: the division the hepatocytes
2.3 乙醇对肝细胞脂肪酸氧化速度的影响 乙醇能够明显抑制肝细胞的脂肪酸氧化速度，正常培养的肝细胞脂肪酸氧化速度为3.12nmol/mg protein/h，而在20mmol/L的乙醇存在的情况下脂肪酸氧化速度为1.76pmol/mg protein/h，降低约40%左右，具体结果见图2。
图2 乙醇对体外培养肝细胞脂肪酸氧化速度的影响
Fig 2 The effect of ethanol to the rate of fatty acid oxidation of cultured hepatocytes
