X-连锁无丙种球蛋白血症的研究进展
【关键词】 X-连锁无丙种球蛋白血症（XLA）；Burton酪氨酸激酶（BTK）；诊断；治疗
【Abstract】 X-linked agammaglobulinemia（XLA ）belongs to the primary immunodeficiency disease（PID），which calls Bruton disease.Recently，it can not generate immune globulin，because of the mutation of the Bruton’s agammaglobulinemia tyrosine kinase （BTK） gene，which leads to developmental disorder of the B cell.This article reviews the genetic characters，mutation analysis，molecular pathogenic mechanism and therapy of the BKT gene.
【Key words】 XLA；BTK；diagnosis；therapy
X连锁无丙种球蛋白血症（X-linked agammaglobulinemia，XLA），又称Bruton无丙种球蛋白血症，是最早发现的人类原发性免疫缺陷病（primary immunodeficiency disease，PID）之一，Bruton（1952年）首次报道。患者临床上以反复细菌感染为特征，血清中各类免疫球蛋白明显降低或缺乏，对抗原刺激不能产生抗体应答，血循环中B淋巴细胞减少，淋巴结及淋巴组织缺乏生发中心和淋巴滤泡，骨髓中无浆细胞，但前B淋巴细胞数量正常，T淋巴细胞数量及功能正常。典型病例为出生后半年左右开始反复化脓感染（如肺炎链球菌或嗜血流感杆菌）或迟至幼年发病，患者体内缺少成熟B细胞，基本上不能自主产生免疫球蛋白，必须依靠免疫替代疗法维持体液免疫水平。该病严重危害患者健康，危及患者生命。80%～90%［1］临床诊断病例可检出相关致病基因BTK发生突变，而其他10%～20%［1］的病人存在其他问题，有研究显示常染色体编码Igφ［2，3］、μHC［4］和LC的基因存在突变。
1 BTK的遗传学特性大多数PID的遗传形式已经明确，几乎均为单基因遗传，多数为常染色体隐性遗传，其次为X连锁隐性和常染色体显性遗传。大多数情况男性发病，女性携带，但也有男性携带者不发病的报道。60%的PID突变基因的DNA序列已被克隆，突变位点（包括突变基因定位的染色体节段和基因位点）和突变形式（单个核苷酸缺失、替代、插入、移码突变、无义或错义突变等）也已确定［5］。在WHO PID专家委员会的指导下，成立了有关疾病基因库，记录登记全球范围的PID基因突变及其类型。多基因遗传性PID的确定较困难，至今尚无确切的报道。
1.1 BTK的蛋白结构 BTK蛋白为B细胞信号传递系统中的重要蛋白，属于非受体型蛋白酪氨酸激酶Tec家族的一员，该家族的成员还包括TEC、ITK/TSK/EMT和BMX。Tec家族蛋白酪氨酸激酶包括5个不同的结构区段（见图1），从N末端起为PH（pleckstrin homology；PH）段，约有120个氨基酸，TH（Tec homology；TH）段约有60～80个氨基酸SH3（Src homology3;SH3）段约有60个氨基酸，SH2段约100个氨基酸，激酶催化段约280个氨基酸［6］。
图1 BTK蛋白的组成（从N端开始）包括5个区域：PH、TH、SH3、SH2和激酶区。
注：图上边的数字代表各段的氨基酸长度，图下边的数字代表不同的外显子及其相应的位置。
BTK蛋白的空间结构多数已测明，包括PH区、TH区的前半部、SH3区和激酶催化区［7］，SH2区的结构可借用其他蛋白激酶的类似结构进行研究。这些三维空间结构可用于分析突变造成的蛋白空间结构的改变。
1.2 BTK基因的分子结构及其突变分析 在20世纪80年代，多位学者应用DNA多态性标志分析的方法，成功地将XLA的缺陷基因定位于X染色体中部（Xq21.3-22）的2cm区域内［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病变基因区内分离鉴定了一个新的基因，该基因表达于正常人各期B淋巴细胞，在XLA患者中发生突变，故认为是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全长37.5kb，含有19个外显子，除第一外显子外，其余18个编码BTK蛋白的659个氨基酸，分子量为76KD［9］。cDNA含有2560个核苷酸，有一个编码659个氨基酸多肽的开放阅读框架，起始密码子在核苷酸第133位置上，在起始位置上游的15个密码子处阅读框架闭合。根据国际研究小组BTK突变分析，迄今已经在471个家族544个XLA病人中发现了BTK基因341个独立存在的碱基置换、插入或缺失，其中有13个大段缺失和2个大段插入。突变不仅存在于19个外显子，还涉及内含子和启动区域。其中，发生频率最高的是错义突变，其次是无义突变和拼接位点突变。错义突变主要发生在三联体密码子的前两位。外显子8和9的185~287位没有错义突变，这些位点可能不易突变或是功能上不重要。33%的替代累及CPG双核苷酸，这是目前认为的最常见的突变热点［10］，而突变高频位点R520也属于CPG突变［6］。编码外显子蛋白突变的区域［11］（见表1）。表1 编码外显子蛋白突变的区域
2 BTK的分子致病机制BTK属于非受体酪氨酸蛋白激酶，该类激酶广泛参与细胞信号传导，影响细胞的存活、增殖和分化，BTK是B细胞发育成熟的关键因素。正常人除T细胞和浆细胞外均有BTK表达，而BTK基因突变只影响B细胞的数量，这说明BTK在B细胞的生长发育过程中起着至关重要的作用。目前对BTK参与细胞信号传导研究比较清楚的是BCR交联介导的信号传导途径。其过程简述如下：BCR交联激活Pl-3激酶并产生一定数量的Pl-3，4，5-risphosphate与膜结合，Pl-3，4，5-risphosphate与BTK的SH3段作用使其定位于细胞膜。然后，BTK经过两步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是与Lyn作用），接着是SH3段Y223位的自身磷酸化。活化后的BTK与B细胞衔接蛋白（BLNK）结合并激活phospholipase C -γy（PLC-γ），导致钙离子通道打开，胞外钙离子内流。该信号传导途径最终导致细胞增生加强和转录的变化。此模式仅限于以B细胞受体交联作为刺激信号，至于前B细胞受体交联是否也引起相同的信号传导目前还缺乏证据［1，12］。该信号传导途径受FcRⅡB和SHIP（ SH2-containing inositol-5-phosphatase）磷酸酶介导的另一途径制约，通过水解Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate关闭钙离子内流通道［13］。BTK不仅可以由BCR和FCR介导激活，也可以通过其他很多受体激活，包括G-protein-coupled receptors（ GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和单克隆抗体的交联也可激活BTK［13］，近年来研究表明，CD40也是B细胞发育过程中的重要受体，传递刺激信号影响细胞存活、生长和分化。与BCR介导的BTK活化途径相似，CD40的交联也可激活BTK。CD40和BCR可能是B细胞发育过程中不同阶段激活BTK的信号传递通路。但也有研究提示CD40不通过BTK也可提高NFKB和JNK的水平，是独立于BTK的信号传导通路［14～16］。BTK在细胞内与很多分子相互作用，共同构成了一种微环境，在信号传导的过程中起着重要的作用。这些分子分别与BTK的不同区段相互作用，其中与PH段作用的分子研究得很多，R28附近区域与PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH- TH区域与Gαq和Gβ双体作用;SH3与c-Cb1、WASp、Vav和sab作用;SH2与磷酸化的BLNK作用。另外，SH3与TH在BTK分子内作用，抑制BTK的活性。在BCR交联介导的信号传导途径中，Syk和BLNK对BTK的活化起正向调节作用，磷酸化的PKCs、sab和IBTK对BTK的活化有抑制作用。尽管与BTK作用的分子很多，但是它们如何协调地与BTK作用，完成BTK参与的信号传导，机制目前尚不清楚［17，18］。
3 XLA的诊断XLA是一种原发性体液免疫缺陷症，危害着人们的健康。因而，对该症进行产前诊断和女性携带者的鉴定就显得十分重要［19］。为了研究XLA家系女性成员的情况，Fearon等采用了X染色体失活的方法去发现携带状况以及验证B淋巴细胞发育的内在缺陷。根据这一方法用重组DNA探针同时发现RFLP和X染色体基因甲基化。在无携带状态的女性的外周血粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中发现X染色体的随机失活。相反，该症的三个携带者在外周B淋巴细胞两个X染色体中的一个优先失活，但不是T细胞或粒细胞。这一发现强烈地支持XLA是由B淋巴细胞发育的内在缺陷所致的假设。Lovering （1994）等［20］对BTK基因缺失患者DNA分子斑点杂交分析见到了已改变的DNA限制性片段，并对7个患者家庭用已经改变的限制性片段方法对与患者有关的女性携带状况作出诊断。随后，Schuster等［21］报道了对所有19个外显子。包括侧翼内含子边界采用PCR-SSCP方法成功地检测到两例男性患儿BTK的SH2功能区的新突变，并用一个已改变过的第一个引物做PCR扩增突变发生，作出三代中健康女性携带者的鉴定。接着，Hagemann等［22］对一个散发的XLA患儿及家庭的三代成员应用PCR扩增基因组DNA，采用序列分析的方法直接鉴定XLA的基因突变，结果诊断出患儿及其免疫学表现正常的女性携带者。以上这些方法均可应用于产前诊断。这无疑对优生优育是很有意义的。
