抑转丸对Lewis肺癌瘤株转染的C57BL/6小鼠CD44V6影响的实验研究
［关键词］ 抑转丸；Lewis肺癌；CD44V6；益气活血
抑转丸是根据导师陈光伟主任医师在长期的肿瘤临床工作中，理论联系实际，不断总结得出益气活血为法治疗恶性肿瘤转移复发的经验方基础上研制而成的中药复方制剂。该药由西洋参、莪术、山楂、仙鹤草、鳖甲等中药组成，具有益气活血之功。为探讨抑转丸抑制肿瘤转移复发机制，进一步为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 瘤株：Lewis肺癌；实验动物：C57BL/6小鼠（18~22 g）40只（第四军医大学提供）。
1.2 主要药品及试剂 抑转丸（YZP）由青岛市黄岛区中医院制剂中心提供。YZP配制：大剂量按小鼠36 g/kg（相当于临床用量的3倍），小剂量按小鼠12 g/kg（相当于临床用量）用生理盐水分别配制成3.6 g/ml和1.2 g/ml混悬液；兔抗小鼠CD44V6单克隆抗体（BA 0454），兔抗小鼠CD4单克隆抗体（BA0430），S-P试剂盒（武汉博士德生物工程公司 ）；Buin’s液（自配）。
1.3 主要仪器 解剖显微镜（日产Olympus）、电子天平（上海第二分析仪器厂）、超净工作台（guard型，德国）、水平离心机（LD4-2型，北京医用离心机厂）、γ计数器（MH-01型，中创集团北京民华科技公司研制，中国同位素公司监制）。
1.4 方法
1.4.1 模型复制［1］ 将肺癌荷瘤小鼠脱颈处死，放入75％酒精中浸泡10 min，在超净工作台上分离瘤体，取其中生长良好、无坏死的肿瘤组织，用生理盐水冲洗后剪碎，经0.25%胰蛋白酶室温下消化5 min，用组织匀浆器研磨肿瘤组织制成匀浆过300目尼龙网制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1×107/ml，0.2%台盼蓝染色，在倒置显微镜下计算活细胞数，即未染色的细胞数>95％，在每只小鼠右腋皮下接种瘤细胞悬液0.2 ml。
1.4.2 分组 接种瘤组织前把40只小鼠随机分成4组：空白对照组（A组），荷瘤对照组（B组），抑转丸小剂量组（C组），抑转丸大剂量组（D组）。4组动物分笼喂养。适应性喂养1周后，B、C、D组接种瘤细胞悬液，并于24 h后开始灌胃给药：A、B组用生理盐水0.2 ml/（只·d），C、D组分别用浓度为1.2 g/ml、3.6 g/ml的抑转丸混悬液0.2 ml/（只·d），共灌胃21天。
2 检测项目与方法
2.1 测移植瘤重，计算抑瘤率 处死动物后，剥离移植瘤体，电子天平称重，计算抑瘤率；石蜡包埋，连续切片，厚度约4 μm。抑瘤率（%）＝（对照组瘤重－用药组瘤重）／对照组瘤重×100％。
2.2 观察肺转移数，计算肺转移抑制率 方法同上，取血后颈椎脱臼处死小鼠，剥离小鼠肺脏，用电子天平称重，Buin’s液固定，并计算肺转移结节数，计算肺转移抑制率。
2.3 CD44V6检测
2.3.1 检测方法［2］ 用S－P法，将石蜡切片脱蜡至水化，3%过氧化氢室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗3次，每次2 min，PBS液浸泡5 min，将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中加热，使容器内液体温度保持在92 ℃~98 ℃，并持续15 min，10%正常血清（PBS液稀释）封闭，室温孵育10 min，倾去血清，滴加1∶75的CD44V6抗体4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加生物素标记的二抗工作液，37 ℃湿盒中孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加适量辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37 ℃湿盒中孵育30 min，PBS冲洗3次，每次15 min，DBA显色剂显色，显微镜下观察10 min，适时终止反应，自来水冲洗，苏木素复染，脱水透明，中性树脂胶封闭。
2.3.2 对照 阴性对照以PBS取代一抗，阳性对照为已知的阳性片。
2.3.3 CD44V6结果测定［3，4］ 以细胞膜呈棕黄色为阳性，随机计数5个视野，根据阳性细胞所占比例分为阴性（－）：即阳性细胞数<5％；阳性（＋）：即阳性细胞数≥5％。
2.4 统计学方法 试验结果数据均用均数±标准差（x±s）表示，统计学处理分别用χ2检验和t检验。
3 结果
用药后观察小鼠一般情况，4组小鼠移植瘤均存活并生长，用药过程中各组小鼠活动正常，反应灵活，无毛色枯槁、腹泻、消瘦等，空白组与荷瘤组各1只小鼠在灌胃过程中死亡，尸检为液体灌入气管窒息所致。
3.1 各组出瘤时间比较 见表1。C组和D组的出瘤时间分别与B组比较差异均具有非常非常显著性（P<0.01），C组与D组的出瘤时间比较差异无显著性（P>0.05）。表明：大、小剂量YZP组与荷瘤对照组相比较均能明显延长C57BL／6小鼠的出瘤时间，大剂量YZP与小剂量YZP延缓出瘤时间的作用无差异。表1 各组出瘤时间的比较注：C组、D组与B组对比，*P<0.01；D组与C组对比，△P>0.05
