榄香烯联合生物大分子合成抑制剂对Hca-F肝癌的作用
作者:郭连英，陈 骏，沈 洁，邢 嵘1，施广霞，钱振超
【摘要】 目的 本实验采用榄香烯与生物大分子合成抑制剂联合处理小鼠肝癌细胞Hca-F，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制/干扰肿瘤细胞的DNA、RNA或蛋白质合成对榄香烯抗瘤作用的影响，以期为判断榄香烯作用的可能靶点提供线索与依据。方法 将Hca-F肝癌细胞用榄香烯（50μg/ml）、吡柔比星（THP）（10μmol/ml）、单独和复合处理，设单独瘤细胞（不处理）为阴性对照。Hca-F细胞浓度均为1×106/ml，每个观察时间点均设3支复管，用台盼蓝拒染法计算细胞存活率，在透射电镜下观察榄香烯与THP联合处理对肿瘤细胞超微结构的影响，用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果 榄香烯联合吡柔比星处理Hca-F比单独使用两种药物的抑瘤率都高。结论 本实验所用生物大分子合成抑制剂不能阻断榄香烯的抗瘤作用，提示榄香烯抗肿瘤作用对新的蛋白质表达依赖性较低。结合榄香烯处理后瘤细胞形态学的变化，提示榄香烯可能作用于肿瘤细胞膜或细胞中的某些蛋白质（如酶）等而直接杀伤肿瘤靶细胞，使对榄香烯抗瘤作用靶点的认识又进了一步。本实验结果表明榄香烯和THP合用可使抗癌作用增强，这对榄香烯联合其他药物治疗肿瘤可能有一定参考意义。
【关键词】 榄香烯；抑制剂；肝细胞癌
The effect of elemene combined with inhibitors of macromolecular synthesis for hepatic cancer
【Abstract】 Objective In this experiment of Hca-F cells (a murine hepatic cell carcinoma) were treated with elemene combined with inhibitors of macromolecular synthesis， their proliferation， survival， cell cycle， apoptosis and morphology were observed. To clarify the influences of inhibition of DNA， RNA and protein on the antitumor effects of elemene and to find the possible target site of elemene.Methods The Hca-F cells were singled or mingled treated with elemene（50μg/ml），alone or combined with THP （10μmol/ml）， the Hca-F cells(without treatment) were used to be the negative compare. The end consistence of Hca-F cells is 1×106/ml， three tubles in every time point. To calculate the proportion of survival with trypanblue， and observe the impact on the ultrastructure of Hca-F cells treated with elemene and THP in transmission electron microscope， and examine the apoptosis and cell cycles in flow cytometer. Results The inhibition rate of proliferation of Hca-F treated with elemene and THP was higher than that of Hca-F treated with elemene only.Conclusion These results showed that the antitumor effects of elemene could not abolished by combined treatment or pretreatment with the inhibitors of DNA， RNA， protein synthesis， which suggest that the antitumor effects of elemene may be independent on their synthesis. Combined usage of elemene with THP to cancer therapy is advisable.
【Key words】 elemene；inhibitor；hepatocellular carcinoma
榄香烯(elemene)是从中药温莪术（经鉴定为我国特有新种定名为温郁金，Curcuma Wenyujin）挥发油中提取的抗癌有效成分，它是一种仅含碳氢(C15H24)，分子量只有204的小分子、脂溶性的倍半萜类化合物， 此类物质有抗癌活性属我国首报［1］。动物实验与临床应用均表明榄香烯的抗癌作用确切，而且不良反应很低。我们过去的研究表明榄香烯处理除可抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡外，还能增强肿瘤细胞的免疫原性，榄香烯处理能增强肿瘤细胞膜HSP70的表达，用表达谱基因芯片技术的研究表明榄香烯处理引起基因表达谱的变化。过去对榄香烯抗癌作用机制的研究仅限于榄香烯对肿瘤细胞增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影响，关于它的作用靶点及其信号传导通路迄今研究很少。本实验在上述研究的基础上，采用榄香烯与生物大分子合成抑制剂联合处理小鼠肝癌细胞Hca-F，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制或干扰肿瘤细胞的DNA、RNA或蛋白质合成对榄香烯抗瘤作用的影响，以期为判断榄香烯作用的可能靶点提供线索与依据。
1 材料与方法
1．1 动物 Balb/c系小鼠，引自中国医学科学院北京药物研究所，由本室自行繁殖提供。
1．2 瘤株 小鼠腹水型肝癌H22的高淋巴道转移亚系Hca-F［2］，由本校病理学教研室凌茂英教授赠送，本室常规传代、保种。
1.3 主要药品和试剂 1%榄香烯注射液(elemene，大连市医药科学研究所 )。吡柔比星(Pirarubicin，THP，深圳万乐药业有限公司生产)。RPMI1640培养基（GIBCO，USA）。
1.4 Hca-F细胞悬液的制备 将传代保种的Hca-F腹水型肝癌细胞常规接种于小鼠腹腔，0.2ml/只，收集第7～8天的腹水（肿瘤细胞生长最旺盛时期，死亡细胞和红细胞含量较少），HS液破除红细胞，PBS 洗3次，计活细胞数，用含20%小牛血清RPMI1640培养液调细胞数至所需浓度。
1.5 Hca-F肝癌细胞的处理 将Hca-F肝癌细胞用榄香烯（50μg/ml）、吡柔比星（10μmol/ml）按本室常规方法单独或复合处理，设单独瘤细胞（不处理）对照。Hca-F细胞浓度均为1×106/ml，每个观察时间点均设3支复管，加入相应的药品，以台盼蓝拒染法于不同时间计数活细胞数，计算存活率。
1.6 单纯榄香烯处理和榄香烯联合THP处理对Hca-F增殖的影响 用MTT法测其OD值。
1.7 榄香烯联合THP处理对瘤细胞超微结构的影响［3］ Hca-F细胞用榄香烯、THP单一或复合处理，细胞浓度和处理方法同前，处理时间为1h，收细胞，用PBS洗3次，以2.5%戊二醛固定，常规包埋制片，铀—铅双染色，透射电镜下观察摄片。
1.8 细胞凋亡的检测和细胞周期的测定 细胞收集同前，用PBS洗3次，加入 PI染色液染色30min（避光、室温）。上机检测，Cellquest软件低速获取。用Modfit2.0软件分析。
2 实验结果
2.1 榄香烯联合THP处理对Hca-F存活的影响 单纯用榄香烯处理，Hca-F的存活率就明显降低，在30min～1h的时间内，细胞死亡率随着药物浓度增加而增加（表1），单用THP处理，也可导致Hca-F细胞死亡、蓝染，其细胞死亡率也随着药物浓度增加而增加，榄香烯联合THP处理，肿瘤细胞死亡率可达100%。
表1 榄香烯单独或联合THP处理对Hca-F细胞存活的影
2.2 榄香烯和THP联合处理对Hca-F细胞周期与凋亡的影响 实验结果表明榄香烯与THP联合处理对Hca-F细胞周期变化的影响及凋亡细胞百分率变化与单用THP相比也无明显区别， 榄香烯处理与不处理Hca-F对照组细胞各时相百分率及凋亡细胞百分率变化无明显区别（见表2和图1）。
