应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光免疫试剂
［关键词］ 妊娠相关血浆蛋白A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素—生物素—聚乙烯胺—4,7二氯磺苯基?1，10啡罗啉?2，9二羧酸—铕复合物；唐氏综合征
Develop A Direct Solid Phase Lanthane Time?resolved Fluoroimmunoassay Reagent of PAPP?Autilizing PVA
Abstract :Objective To develop a direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassayreagent of PAPP?A by synthesizing a complex of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+. Methods Polyvinylamine (PVA) was labeled with biotin?streptavidin and europium chelate of 4,7?bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicarboxylic?acid(BCPDA). Using labeled PVA complex,We designed two?site sandwich time?resolved fluoroimmunoassay of PAPP?A and evaluated assay characteristics of PAPP?A kit .Results We successed synthesizing a conjuagete of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+ and a reagent of PAPP?A. Detection limits achieved were 0.7mIU/L.The calibration curve was linear 0?10000mIU/L.Intra? and interassay imprecision (CV) was 3.89%?4.96% and 7.35%?9.27%.Recovery was 95.8%?104.2%. Conclusions The conjugate of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+ synthesizied was reactive ,highly fouorescent. A sorts of kit could be synthesized ,taking advantage of it. The reagent of PAPP?A was potentially suited for use in clinical with highly analytical sensitivity.
Key words: Pregnancy associated plasma protein A;Direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassay; Streptavidin?biotin?Polyvinylamine? europium chelate of 4,7?bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicarboxylic?acid; Down's Syndrome
妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy associated plasma protein A，PAPP?A)是一种高分子α2糖蛋白，20世纪70年代在孕妇血清中被发现［1］。在孕妇血中主要PAPP?A是胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为200 000~250 000亚基构成。PAPP?A亚基和两个嗜红细胞主要基础蛋白(Proform of eosinophil major basic protein)以二硫键结合而成［2］，在孕妇血中只存在微量游离单体PAPP?A。PAPP?A亚基由1 547个多聚核苷酸构成，包括1个拉长的锌指结构，3个Lin—notch重复序列，以及5个短一致重复序列［3］。在体内PAPP?A是一种蛋白酶，主要针对胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP?4)和胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP?5)起作用。胰岛素样生长因子I(IGF?I)在促进细胞分裂和增殖起重要作用，它主要通过IGF?1受体起作用，IGF?I、II的生物活性受6个高亲和性IDFBP调节［4，5］。PAPP?A主要用于产前筛查唐氏综合征(Down's Syndrome，DS)，迄今医学上对此病尚无有效的治疗和预防措施，只能通过产前筛查防止DS儿的出生，但目前开展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵入性检查,有1%～3%的流产率,且方法繁琐,出报告时间长,不适宜大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。大量报道认为PAPP?A可作为DS胎儿产前筛查的的标志物。在15周～20周通过结合孕妇孕周、超声诊断和Freeβ?HCG可以鉴别65%～75%，但要在3个月～6个月结合AFP、游离E3以及抑制素上述成分可鉴别85%～90%［6］。有文献［7］报道PAPP?A在急性冠状动脉综合征(ACS)的早期诊断有一定的意义，PAPP?A在ACS患者血清含量＜30 mIU/L，同时结构不同于孕妇体内的PAPP?A且存在动态变化，必须利用超灵敏的方法进行检测。国内PAPP?A的诊断试剂大多为ELISA和PerkinElmer公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫分析(dissociated enhance lanthane time?resolved fluoroimmunoassay,DELFIA)试剂，无国产PAPP?A时间分辨荧光试剂。我们利用PVA(聚乙烯胺)作为载体结合BCPDA镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫分析(direct solid phase lanthane time resolved fluoroimmunoassay,DSLFIA)试剂。为提高检测灵敏度和克服BCPDA标记抗体使抗体失活的问题，我们引入了生物素?亲和素(biotin?streptavidin system)系统。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 4,7二氯磺苯基?1，10啡罗啉?2，9二羧酸［4,7?bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicarboxylic acid,BCPDA自制］；纯化亲和素(Streptavidin，SA ，Sigma公司)；硫代琥珀酰亚氨?6生物素氨基?己酯类［Sulfosuccinimidyl?6'?(biotinamido)?6? hexanamido hexanoate，Sulfo?NHS?LC?LC?Biotin， pierce Chemical Company］；聚乙烯胺氢氯化物(Polyvinylamine hydrochloride， PVA,Chemical Dynamics Corp) ；硼酸钠、二甲亚砜(天津化学试剂有限公司)；单克隆抗体根据文献［5］选择Hyb234—5(Statens serum Institut)作为检测抗体，mAb 10E1(HyTest Oy，Finland)作为捕获抗体；PAPP?A标准品和质控品购于PE公司(质控血清：Control1 508 mIU/L，Control2 2 325 mIU/L，Control3为4 952mIU/L)；鼠IgG(晶美公司)。
1.1.2 仪器 Wallac?1420多标记计数仪(Wallac OY，Finland )；HPLC 硅柱TSK?250尺寸排阻柱( BIO?RAD公司)；96白色微孔板( NUNC公司)、亲和素包被板(Innotrac Diagnostics Oy公司)；Amicon可浓缩离心管(Amicon microconcentration units ，MW 30 000 Cut?off)
1.2 方法
1.2.1 BCPDA的制备 参见文献详细步骤［8～10］。
1.2.2 生物素?聚乙烯胺?BCPDA［(Bio)x?PVA?(BCPDA)y］复合物的构建［11］ 用0.5 M的碳酸盐(pH 9.1)缓冲液配制浓度为10 mg/ml聚乙烯胺(PVA)溶液 ，将200 μg NHS?LC?LC?Biotin溶于20 μl碳酸盐缓冲液中，取200 μl上述PVA溶液加入20 μl上述NHS?LC—LC?Biotin溶液中，振荡混匀，室温反应1.5 h(PVA∶Bio=1∶15)，用0.5 M碳酸盐缓冲液将混合液稀释到1 ml，将固体BCPDA研磨成粉末状，先在上述1 ml混合液中加入5 mg BCPDA，用力搅拌，直到溶解，重复加3次BCPDA，5 mg/次，共计20 mg BCPDA，在室温放置5 h～6 h，直到溶液澄清，转移到透析袋中，用0.1 M NaHCO3 5 L透析、过夜、重复透析2次，尽可能除去没反应的BCPDA和生物素。
1.2.3 HPLC纯化(Bio)x?PVA?(BCPDA)y复合物 离心浓缩上述(Bio)x?PVA?(BCPDA)y复合物到0.3 ml～0.5 ml(用Amicon microconcentration units ，MW 30 000 Cut?off)。流动相0.05 M Tris缓冲液(pH 7.70)，控制HPLC流速0.8 ml/min，在325 nm处监测层析液(325 nm为BCPDA最大吸收峰)，上样后，马上收集，(Bio)x?PVA?(BCPDA)y在10管～16管约5 ml左右，取10 μl(Bio)x?PVA?(BCPDA)y层析液加入90 μl水滴入亲和素包被板微孔中，温育30 min，洗板，加入用Tris缓冲液配制的10 M～5 M EuCl3 100 μl，反应10 min，洗板、干燥，用Wallac?1420检测Eu3+的荧光强度，没结合复合物的被洗去了，没结合BCPDA的复合物因无法结合Eu3+而没有荧光，计算标记的PVA，大约每分子结合50个～100个BCPDA分子。
1.2.4 构建亲和素?生物素?PVA?BCPDA ［(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+］复合物［11］ 用0.1M Tris缓冲液(pH 7.8)配制小牛血清白蛋白(BSA溶液)60 g/L，同时加入EuCl3，使Eu3+浓度为10-6 mol/ml，用双蒸水配制亲和素溶液浓度为1 mg/ml，取上述BSA溶液1 ml，加入10 μl亲和素溶液，再加入50 μl的(Bio)x?PVA?(BCPDA)y复合物(通过固相免疫分析，棋盘滴定法确定最佳用量比，步骤略，结果见后)，混匀，55 ℃温育1.5 h，4 ℃保存备用。
1.2.5 (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物反应活性 用生物素化的各种浓度(0 ng/50μl，0.5 ng/50μl，5 ng/50μl，50 ng/50μl，100 ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板(同第7步)，用60 g/L BSA和0.1 mol/L Tris缓冲液(pH 7.8)10倍稀释(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，在板的微孔中加入100 μl稀释后的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，室温反应30 min，洗板、干燥，测量荧光强度(cpm)。本实验是验证复合物的反应活性。
1.2.6 生物素标记10E1抗体［12］ 用二甲亚砜制备硫代琥珀酰亚氨?6生物素氨基?乙酯溶液(10 mg/ml)，将抗体10E1溶于0.1 mol/L硼酸钠溶液(pH 8.8)，每1 mg抗体中加硫代琥珀酰亚氨?6生物素氨基?己酯类溶液210 μg混合，室温放置4 h，在上述溶液中加入20 ml 1 mol/L NH4Cl，室温反应10 min，将反应液进行透析，除去未结合的生物素，将抗体浓度用分析缓冲液配置成8 ng/μl，-20 ℃保存备用。
1.2.7 单克隆Hyb234—5抗体包被96孔微滴定板 将抗体溶于0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 4.9)，配置成5 μg/ml抗体溶液，在每一孔中加入80 μl抗体溶液，室温反应20 h，然后用生理盐水洗3次，然后每孔加120 μl 0.05 M Tris?Hcl 缓冲液(pH 7.4含0.9%生理盐水、0.05% NaN3、0.5%小牛血清白蛋白BSA)浸泡2 h。吸干缓冲液，干燥，密封4℃保存。
1.2.8 样本收集、定标、灵敏度、精密度和回收实验分析过程 选取怀孕8周、9周、11周妇女血清各一份，经PE公司的DELFIA试剂和D&G公司的ELISA试剂多次精确测定，值分别为：P1 863.27 mIU/L；P2 1 273.63 mIU/L；P3 2 727.23 mIU/L。用标准品稀释液(6% BSA?TSA缓冲液：150 mmol/L NaCl、60 g/L BSA、50 mmol/L Tris?HCl，pH 7.8)将标准品稀释浓度为：S0 0 mIU/L(稀释液)、S1 20 mIU/L、 S2 200 mIU/L 、S3 1 000 mIU/L 、S4 5 000 mIU/L 、S5 10 000 mIU/L。标准品定标根据WHOIRP78/610(WHO International Laboratory for Biological standards，Statens Seruminstitut，Denmark)，单位换算：1 000 mIU/L=4.5 μg/ml。在单克隆Hyb234—5抗体包被96孔微滴定板，每孔加入定标液10 μl，作8次平行测量，加入50 μl生物素标记10E1抗体50 μl，混匀，36 ℃，室温反应20 min，洗板6次，加入100 μl 10倍稀释的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，室温反应25 min，洗板6次，吹干，Wallac?1420测量荧光强度(cpm)，取均值，作标准曲线。将S0 0 mIU/L做20次重复测试，计算均值(X)和标准差(s)，以X +2s为试剂的最小检测限。将Control1，Control2 ，Control3 依据定标分析过程，同批测量20次，批间测量12次，用于评价精密度。对收集样本(P1 、P2 、P3 )依据定标分析过程进行测量，然后将Control1、Control2、Control3分别等体积加入P1 、P2、P3中进行测量，用于评价回收实验。
