应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光免疫试剂
2 结果
2.1 用HPLC纯化(Bio)x?PVA?(BCPDA)y复合物 在10 min～16 min 出现(Bio)x?PVA?(BCPDA)y的吸收峰，没有结合BCPDA的吸收峰在17 min～24 min出现,见图1。
图1 净化（Bio）x－聚乙烯醇（BCPDA）y在高性能液化色谱（TSK－250过滤柱）上的变化图。（略）
流速控制在0.8 ml/min，吸光率325 nm
2.2 用滴定法确定亲和素和(Bio)x?PVA?(BCPDA)y最佳配比 SA量恒定0.01 mg/ml，生物素标记的抗体包被分别浓度为0 ng/孔、0.5 ng/孔、5 ng/孔、50 ng/孔，缓冲液为pH 7.8 Tris?Hcl 0.1M，Eu3+ 10-5 M，(Bio)x?PVA?(BCPDA)y用量从40 μl～55 μl选择最佳值，50 μl复合物荧光强度值(cpm)最佳，如图2。
图2 滴定链球菌，（Bio) x－聚乙烯醇（BCPDA）y在10-3 M Eu3+,0.1 M Tris-Hcl buffer(pH 7.8)缓冲液中的变化，0.01 mg/ml 链球菌，容积变动范围40 μl~55 μl，观察到最佳容积为50 μl（略）
2.3 验证活性 用生物素化的各种浓度(0 ng/50μl，0.5 ng/50μl，5 ng/50μl，50 ng/50μl，100 ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板验证(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物的反应活性，在测定范围内成线性分布，见图3。
图3 IgG维生素定量法标定曲线（略）
2.4 PAPP?A定标曲线及灵敏度 在0 mIU/L～10 000 mIU/L范围内定标曲线为线性分布，见图4。S0标准重复20次检测均值加2个标准差值代入标准曲线，计算出检测限为0.7 mIU/L(数据没显示)。
图4 PAPP-A标定曲线（略）
2.5 批内、批间精密度 对质控血清批内进行20次分析，批间进行12次分析，得到批内变异系数3.89%～4.96%,批间变异系数在7.35%～9.27%之间,见表1。
表1 批内、批间变异系数比较（略）
2.6 回收实验 对收集样本(P1 、P2 、P3 )依据定标分析过程进行测量，然后将Control1、Control2、Control3分别等体积加入P1 、P2、P3中进行多次测量，分别计算回收率95.8%～104.2%,见表2。
表2 回收实验结果比较（略）
3 讨论
临床化学家最关心的问题是分析技术灵敏度，这也是临床诊断试剂的核心。近来，在临床化学检测物质的浓度的范围10-3 mol/L～10-16 mol/L。PCR以及其他的体外扩增技术使DNA、RNA检测方便、高效、特异。不幸的是蛋白不能复制，最敏感的定量方法是依靠蛋白之间的特异性结合如抗原抗体反应。一个提高蛋白检测灵敏度的方法就是信号放大，即在蛋白上标记可以检测的标记物，通过标记物的信号放大而达到更容易检测的目的。时间分辨免疫学技术是80年代迅速发展起来的的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术，其中荧光镧系螯合物具有较大的Stokes 位移(275 nm)，较窄的发射光谱(10 nm)，较长的荧光寿命(10 us～1 000 us)，而被广泛构建时间分辨荧光免疫试剂。临床运用最广泛的是PE公司生产的解离增强镧系时间分辨荧光免疫分析(dissociation?enhanced lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA)试剂 ，它必须使Eu3+与螯合物分离，由于其信号较弱，必须加入增强液来发大信号，操作烦琐且在加样的过程中可能引起外源性的污染，这些弊端影响了它的应用。在1987年，Evangelista和Diamandis合成一种新的螯合物BCPDA，开创了固相时间分辨免疫荧光技术，解决了DELFIA上述问题［8，9］，但是BCPDA的较大分子量、表面特性和直接标记蛋白容易引起蛋白的失活对它应用带来一些问题，解决的办法就是连接一个载体。我们实验中引入了PVA作为载体，连接BCPDA和生物素?亲和素。PVA直接连接蛋白技术难度较大，而生物素标记蛋白技术比较成熟，同时亲和素有4个生物素结合位点，可以起到信号放大作用，而提高检测灵敏度。我们实验中成功的合成了(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，用它去识别生物素标记的抗体(见图3)，结果显示亲和力非常高。实验关键问题是选择SA和(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物最佳比，我们实验中做了7个浓度梯度，选取结合后荧光强度最大的(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物浓度。利用HPLC层析纯后的(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物回收率是68%。通过实验选择最佳检测抗体浓度、生物素化抗体浓度和标本用量。Jackson［13］分析了提高灵敏度的因素即两个关键的因素与最终的结合分析灵敏度相关：我们监测标记分子(放射性同位素、化学发光剂、荧光团)的能力；结合试剂的质量和实验条件，在临床化学存在一种误导是特别敏感的监测方法(化学发光、时间分辨荧光)能获得好的结果。其实这是错误的，如果实验试剂和条件(抗体的亲和性和特异性，固相结合物的自然特性以及清洗效率)不被选择，很难达到理想的检测效果。为达到较高的灵敏度，需要选择高灵敏度的标记技术、高亲和力的试剂和最好的分析条件(可将试剂的非特异性结合降到最小)。利用镧系螯合物的时间分辨荧光免疫分析是一种高灵敏的标记技术，关键是实验条件的选择，我们验证不同孵育时间下，(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物产出率，以及和生物素化抗体的结合能力(数据不能显示)。经过大量的实验选择了Eu3+的浓度，使其能和BCPDA形成最佳比例(数据不能显示)。反应条件的建立中，我们筛选实验反应温度(18 ℃～56 ℃，每5 ℃选择一次)和反应时间(10 min～24 h)，考虑到临床结果的报告时间，选择了20 min(数据不能显示)。经过实验条件选择，形成了PAPP?A的定标曲线，通过定标曲线确定最低检测限(见图 3)。我们构建的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物可以用于多种像PAPP?A这样利用双抗体夹心法检测的试剂，如AFP等。我们选择构建PAPP?A主要考虑到我国产前筛查项目的自产试剂较少，而且DS筛查尤为重要，由于科研经费的问题，没有进行最佳单抗配对实验，只是参考了国外的相关文献。不过我们实验的核心是构建(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，为以后构建其他试剂做一定的前期工作。我们构建的PAPP?A试剂,回收实验和精密度试验显示，完全满足试剂盒要求。在今后的工作中，我们主要验证(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物和成品试剂盒的稳定性，以及进一步和PE公司的PAPP?A的DELFIA试剂做大量的临床对比实验。总之，我们成功构建了(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物和PAPP?A的成品试剂，它有较高的灵敏度、准确度和精密度，又克服了DELFIA试剂的缺点。
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